河南和河北冬小麦区假禾谷镰孢的遗传多样性

【目的】运用ISSR-PCR技术揭示中国河南和河北省冬小麦区6个地理群体小麦茎基腐病优势病原菌假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)的遗传多样性。【方法】利用筛选的17个ISSR引物对从河南和河北冬小麦区收集的166株假禾谷镰孢菌株进行扩增。根据群体扩增的结果,用POPGENE version l.32软件计算各项遗传多样性参数。根据不同地理群体的遗传相似系数,用NTSYSpc version 2.11软件进行群体聚类分析。【结果】从97个ISSR引物中筛选出了17个多态性较好的引物,用这17个引物对河南和河北冬小麦区的166株假禾谷镰孢菌株进行扩增,共扩增出234个DNA片段,其中多态性位点为218个,占总扩增片段的93.16%。平均每个引物可以扩增出13.76个条带,扩增产物大小在150—2 500 bp。POPGENE分析表明,6个地理群体的多态位点数在58—208,平均为124;多态位点百分率在24.79%—88.89%,平均为52.92%;有效等位基因数在1.1548—1.3293,平均为1.2584。遗传多样性分析表明,在地理种群水平上,Nei’s基因多样性指数在0.0897—0.2069,平均为0.1548;Shannon’s信息指数在0.1337—0.3257,平均为0.2368,这表明不同地理群体间存在一定的遗传变异。河南北部地区的Shannon’s信息指数和Nei’s基因多样性指数最高,表明该地区假禾谷镰孢菌株之间的遗传多样性最丰富。河南南部地区的Shannon’s信息指数和Nei’s基因多样性指数最低,表明该地区假禾谷镰孢菌株之间的遗传多样性最低。遗传相似性分析证明,河南北部地区假禾谷镰孢种群和河南东部地区种群最近,河南南部地区假禾谷镰孢种群和河南东部地区种群最远。6个地理群体间的遗传分化系数Gst为0.1571,群体内为0.8429,群体内多样性大于群体间的多样性。6个地理群体间的基因流Nm为2.6819,说明不同地理群体假禾谷镰孢菌株间存在较大的基因流动。6个地理群体总基因多样度Ht为0.1837,各地理群体内基因多样度Hs为0.1548,地理群体间基因多样度Dst为0.0289,这说明相同地理来源的菌株有具有较近的亲缘关系。在遗传相似系数为0.966时,可将6个地理群体划分为2个不同的类群。第Ⅰ类群包括河南北部、河南东部、河南中部、河北中部和河南西部地区,河南南部地区属于第II类群。【结论】河南和河北冬小麦区小麦茎基腐病假禾谷镰孢6个地理群体之间的遗传分化与其地理来源之间有一定的相关性,群体内多样性大于群体间,不同地理群体假禾谷镰孢菌株间存在较大的基因流动。

自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的生长和致病

【背景】假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)引起的小麦茎基腐病是我国小麦生产上的新病害。自噬是真核生物中普遍发生的细胞过程,调控多种植物病原真菌的生长发育和侵染,但其在假禾谷镰孢中的作用还不明确。【目的】明确假禾谷镰孢自噬相关基因FpAtg3在该病菌生长和致病中的作用,解析假禾谷镰孢致病机理,为小麦茎基腐病科学防控提供理论依据。【方法】从NCBI数据库中下载主要真菌的Atg3氨基酸序列,利用MEGA5.05构建系统进化树。利用Split-PCR策略构建FpAtg3基因敲除盒,经PEG介导的原生质体转化导入假禾谷镰孢野生型菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性转化子,并经PCR检测获得FpAtg3基因缺失突变体(ΔFpAtg3)。构建pKNTG-FpAtg3重组载体,导入ΔFpAtg3菌株,利用FpAtg3自身启动子启动FpAtg3的转录,以获得FpAtg3缺失突变体的回补菌株。利用假禾谷镰孢营养生长的培养基PDA、CM和MM测定菌丝生长速率和菌落形态;PDA培养基上测定菌丝形态和菌丝融合率;CMC培养液中测定分生孢子的产量及形态;皮氏培养基上测定孢子融合芽管调控的融合率。将假禾谷镰孢的菌丝块接种小麦胚芽鞘和大麦叶片测定病原菌的致病力,采用盆栽试验测定假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病。在PDA培养基中分别加入刚果红、SDS和过氧化氢测定假禾谷镰孢对细胞壁、细胞膜和氧化胁迫的耐受性。【结果】细胞自噬相关蛋白Atg3在真菌中非常保守,且与生物进化的方向一致,假禾谷镰孢FpAtg3与禾谷镰孢和尖镰孢的Atg3同源性最高。获得了FpAtg3基因缺失突变体和回补菌株,表型测定结果显示,与假禾谷镰孢野生型和回补菌株相比,ΔFpAtg3在营养培养基上的菌丝生长明显减慢,气生菌丝减少,菌丝呈波纹状卷曲,分生孢子产量减少,孢子变短,分生孢子分隔减少;野生型和回补菌株菌丝融合发生非常普遍,在相同条件下ΔFpAtg3的菌丝融合率和孢子融合芽管调控的融合率均明显降低;ΔFpAtg3侵染大麦叶片和小麦胚芽鞘造成的病斑较野生型和回补菌株侵染的病斑明显减小,盆栽试验进一步验证ΔFpAtg3的致病力降低;与野生型和回补菌株相比,ΔFpAtg3在刚果红、SDS和过氧化氢胁迫中的耐受性降低。【结论】自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生、菌丝融合、致病力以及对非生物胁迫的耐受性.

黄淮地区主推小麦品种对根腐病抗性的初步鉴定与评价

为了给根腐病的防治和抗病育种工作提供依据,以小麦根腐病病原菌麦根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)LK030093分离物为接种菌株,对黄淮麦区主推的89个小麦品种进行了室内盆栽苗期抗性和田间病圃成株期抗性鉴定,并采用病情指数法进行了抗性评价。结果表明,供试小麦品种中没有免疫和高抗品种;在室内盆栽接种鉴定中,仅郑麦9962表现为抗病,平安8号和周麦24表现为中抗,淮川916、西农919等33个品种表现感病,平安3号、济麦23等53个品种表现高感,抗病、中抗、感病和高感品种所占比例分别为1.12%、2.25%、37.08%和59.55%;在田间病圃成株期鉴定中,洛麦22、泛麦5号表现为抗病,郑麦9962、阜麦936等19个品种表现为中抗,周麦27、济麦20等35个品种表现为感病,兰考906、石麦12等33个品种表现为高感,抗病、中抗、感病和高感品种所占比例分别为2.25%、21.35%、39.33%和37.08%。可见,黄淮麦区主推品种对小麦根腐病的整体抗性较差,需要尽快加强抗病资源筛选和抗病育种工作。

纳米几丁质制剂对麦蚜的毒力及防效测定

为明确纳米几丁质水悬浮液对麦蚜的防治效果,采用浸虫法测定了不同质量浓度纳米几丁质水悬浮液对3种麦蚜的毒力,采用连续浸液法测定纳米几丁质水悬液、纳米几丁质水悬液与10%吡虫啉WP3000倍液等体积混配液对3种麦蚜的杀虫效果。结果表明,纳米几丁质水悬浮液对麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜的LC50值分别为17.825、20.589、14.381 mg·L^(-1);40 mg·L^(-1)水悬浮液及混配液对3种麦蚜的48 h的杀虫效果分别为80.33%、80.33%、81.67%及96.72%、98.36%、96.67%;田间防效结果表明,纳米几丁质水悬浮液和混配制剂对防治麦蚜具有良好的速效性和持效性。由此推断,纳米几丁质水悬浮液和混合制剂可作为杀虫剂或辅助剂用于麦蚜防治。

假禾谷镰孢细胞凋亡基因FpTatD的鉴定与表达分析

【目的】鉴定和克隆假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)细胞凋亡相关基因FpTatD,分析FpTatD在假禾谷镰孢菌丝、分生孢子和侵染不同时期的表达,为探索细胞凋亡在假禾谷镰孢侵染过程中的功能提供理论依据。【方法】从Gen Bank获得模式物种已知的TatD氨基酸序列,利用BLASTP的方法在镰孢中鉴定TatD同源蛋白,并构建进化树;分别以假禾谷镰孢的基因组DNA和cDNA为模板,通过PCR方法克隆假禾谷镰孢FpTatD的基因序列和开放阅读框(ORF)序列;利用实时荧光定量PCR方法分析FpTatD在假禾谷镰孢生长、产孢及侵染不同时期的表达;利用转录组测序方法分析FpTatD在假禾谷镰孢与感病小麦和抗病小麦互作中的表达差异。【结果】镰刀菌中有4个保守的TatD同源蛋白,与其他物种的TatD蛋白构建系统进化树,发现TatD在进化上分成两个大的分支,第一个分支的TatD在所有物种中都非常保守,包括镰刀菌的TatD1和TatD2,第二个分支的TatD蛋白属于植物和真菌特有的,包括镰刀菌的TatD3和TatD4;克隆假禾谷镰孢的FpTatD1、FpTatD2、FpTatD3、FpTatD4基因长度分别为993、1 331、1 227、1 176 bp,ORF区长度为993、1 182、1 227、1 176 bp。FpTatD2 5′端包含两段长度为94和55 bp的非编码序列,FpTatD1、FpTatD3和FpTatD4均不含非编码序列。4个FpTatD编码蛋白质的分子量大小分别为36.37、43.13、45.59、44.25 k D。蛋白结构和序列分析显示FpTatD蛋白均具有明显的DNase结构域以及大部分保守的氨基酸位点;实时荧光定量PCR分析显示,FpTatD1和FpTatD2在假禾谷镰孢中的表达量高,且在侵染初期阶段明显诱导表达,尤其是FpTatD1在侵染36 h和3 d时分别上调表达8.8倍和7.6倍;而FpTatD3和FpTatD4表达量非常低,且在不同阶段的表达量无明显变化,说明FpTatD1和FpTatD2在假禾谷镰孢中起主要作用;通过分析假禾谷镰孢与感病小麦国麦301和抗病小麦周麦24互作的转录组数据,与实时荧光定量PCR结果一致,FpTatD1和FpTatD2表达量高,并在侵染阶段上调表达,而且相对于假禾谷镰孢与感病小麦的亲和互作中,其与抗病小麦的非亲和互作中,FpTatD诱导表达倍数更高。【结论】假禾谷镰孢细胞凋亡相关基因FpTatD可能参与病原菌与寄主的互作过程。

河南省玉米田根腐线虫三个病样品的病原种类鉴定

短体属线虫(Pratylenchus Flipjev,1936)又称根腐线虫,是一类重要的迁移性植物内寄生线虫,世界范围内分布广泛且危害性大,在我国多个省份皆有发生危害。本文采用改进的贝尔曼漏斗法从河南省商丘市、荥阳市和洛阳市的3个玉米土壤样品中分离出根腐线虫,利用光学显微镜进行形态学鉴定,基于rDNA的ITS和28S D2-D3区序列以及mtDNA-COI序列对供试根腐线虫进行了分子鉴定。形态学和分子生物学鉴定结果均表明来源于商丘样品的SY-1和SY-2种群分别为咖啡短体线虫(P.coffeae)和斯克里布纳短体线虫(P.scribneri);来源于荥阳样品的XY-1种群和洛阳样品的XC-250种群,均为斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)。基于rDNA-ITS、28S D2-D3区和mtDNA-COI序列构建的系统进化树结果与已知鉴定结果相一致,本研究鉴定的短体线虫种类,分别单独聚类在各自分支。本研究明确了河南省玉米田3个病样品的病原种类,发现采自商丘的病样品存在两种根腐线虫复合侵染的现象,且3个病样品均发现斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)的存在,研究结果为玉米根腐线虫病害的识别与防控提供了一定的科学依据。

假禾谷镰孢转录因子FpAPSES的鉴定与功能分析

【目的】假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)侵染小麦引起的小麦茎基腐病严重影响中国小麦的安全生产。查找假禾谷镰孢中的APSES转录因子,分析其在病原菌致病过程中的作用,为解析假禾谷镰孢的致病机制及小麦茎基腐病的防治提供理论依据。【方法】从GenBank获得物种中已知的APSES氨基酸序列,利用BLASTP方法在假禾谷镰孢中查找APSES同源蛋白,利用Pfam软件预测蛋白结构域,采用MEGA5.05构建APSES蛋白的系统进化树。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析A组APSES转录因子基因FpAPSES1和FpAPSES4在假禾谷镰孢侵染过程中的表达。通过PEG介导的原生质体转化和PCR筛选FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株。在PDA培养基上测定假禾谷镰孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突变体菌株的菌丝形态和生长速率;测定在CMC培养液中培养后的分生孢子产生情况、形态以及在无菌水中的萌发率;利用菌丝块和分生孢子接种小麦胚芽鞘和大麦叶片以及盆栽试验测定其致病性;采用ELISA方法测定小米培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的含量。【结果】假禾谷镰孢中有4个APSES同源蛋白,均含有保守的DNA结合结构域HTH。与其他物种的APSES蛋白构建系统进化树,发现FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4属于A组APSES,FpAPSES3分布在C组。FpAPSES1和FpAPSES4在侵染阶段诱导表达,推测可能参与假禾谷镰孢的致病。分别获得2个FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株Δfpapses1-T10、Δfpapses1-T27和Δfpapses4-T1、Δfpapses4-T2。表型测定结果显示,与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在PDA平板上的生长速率明显减慢、色素积累明显增多;FpAPSES1基因缺失突变体菌丝形态无差异,而FpAPSES4基因缺失突变体菌丝弯曲、分支明显增多;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在CMC液体中的分生孢子产生明显减少,分别比野生型下降了99.5%和97.4%,产生的分生孢子变短、隔膜减少、萌发率有所降低;与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体菌丝体和分生孢子对小麦胚芽鞘的致病力明显降低,菌丝在小麦胚芽鞘表皮细胞中的扩展明显受阻;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体对大麦叶片和小麦根部的致病力也明显降低;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在小米培养基中产生的DON毒素分别比野生型下降了约78%和44%。【结论】编码A组APSES同源蛋白的FpAPSES1和FpAPSES4对假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生和致病力均具有重要作用。

豫北夏玉米根际2种根腐线虫的形态和分子鉴定

为明确采集于豫北地区鹤壁市和焦作市玉米根际土壤样品中根腐线虫的种类,采用改良的贝尔曼漏斗法分离土壤样品中的根腐线虫,通过光学显微镜进行形态鉴定,并基于rDNA 28SD2-D3区和rDNA-ITS区的序列对采集的根腐线虫进行分子鉴定。形态学与分子鉴定的结果均表明:来源于鹤壁市的HB-1种群为斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri),来源于焦作市的JZ-257种群为落选短体线虫(P.neglectus)。基于rDNA 28S D2-D3区和rDNA-ITS区序列构建的系统进化树结果表明:供试2种短体线虫分别与GenBank数据库中其它斯克里布纳短体线虫和落选短体线虫处于同一高度支持的分支。本研究结果为玉米根腐线虫病害的识别与防控提供了科学依据。

假禾谷镰孢菌细胞自噬相关基因的鉴定与表达分析

细胞自噬是真核生物中一类包含多种进化保守的Atgs蛋白参与的蛋白质降解途径,该途径也参与多种植物病原真菌的产孢、孢子萌发和致病性过程。本研究利用模式物种已知的Atgs,通过生物信息学分析在假禾谷镰孢菌中鉴定到29个Atgs,分属29种不同蛋白类型。细胞自噬核心调控机制相关蛋白Atg1、Atg6、Atg8和Atg9的氨基酸序列系统进化分析结果显示,Atgs在丝状真菌间非常保守,符合物种进化的特点。通过假禾谷镰孢菌跟亲和与非亲和寄主转录组数据分析发现,与菌丝阶段相比26个Fp Atgs在侵染阶段的表达发生改变,其中Fp Atg1、2、3、4、5、7、8、9、13、22、23、28和Fp Vps34在侵染初期和中后期均诱导表达;Fp Atg6、14、17、20、24、29和Fp Vps15在侵染初期和中后期表达量均降低;Fp Atg10、11除在非亲和互作中后期表达量略有上调,其余阶段均显著下调表达;Fp Atg15、16在亲和互作初期诱导表达,其余阶段均下调表达;Fp Atg26、27在亲和互作初期下调表达,中后期诱导表达,而在非亲和互作初期表达量升高,到中后期下调表达。推测细胞自噬参与调控假禾谷镰孢菌的侵染过程。

咖啡短体线虫不同种群对番茄的寄生性和致病性

为了明确咖啡短体线虫对番茄植株的寄生性和致病性,利用温室盆栽接种和贝尔曼漏斗分离接种植株根际线虫的研究方法,测定了供试咖啡短体线虫5个不同地理种群对番茄的寄生性和致病性以及不同种群之间的致病力差异。结果表明:1)接种75d后供试咖啡短体线虫5个不同种群均能侵染番茄根系,并且在番茄根际的繁殖率(Rf)>1,番茄是供试咖啡短体线虫5个不同种群的适合寄主;2)接种的番茄植株普遍长势弱,叶片黄化,根系减少,根部出现褐色病斑甚至坏死腐烂,线虫危害症状明显;3)接种番茄植株的株高、地上部鲜重和根鲜重等生长参数显著<未接虫的对照组(CK),供试咖啡短体线虫5个不同种群对番茄均具有较强的致病性;4)寄主或地理来源不同的咖啡短体线虫不同种群之间的致病力存在差异,来自河南玉米的HN-K1种群的致病力最强,来自安徽小麦的AH-015A2种群的致病力最弱。综上所述,供试咖啡短体线虫5个不同种群对番茄均具有寄生性和致病性,但不同种群之间的致病力存在明显差异。本研究为番茄根腐线虫病害的识别与防控提供了一定的科学依据。

假禾谷镰孢中三角状五肽重复蛋白的全基因组鉴定与表达分析

假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum,Fp)是引起小麦茎基腐病的优势病原菌,但关于该病原菌致病机理的研究报道很少。三角状五肽重复蛋白(Pentatricopeptide repeat protein,Ppr)为一类核编码的RNA结合蛋白,通过结合特定的RNA序列调控靶标基因RNA的成熟过程,参与线粒体基因组转录和翻译。Ppr蛋白在植物、动物(包括人)及酵母中有一些研究报道,但在丝状真菌特别是植物病原真菌中鲜见报道。为了明确假禾谷镰孢中PPR基因家族的特征,本研究通过全基因组Blastp分析,共鉴定出8个PPR候选基因序列FpPPR1~FpPPR8,主要分布在1号、3号、4号染色体上,基本不含有内含子。理化性质与功能预测显示,Ppr为亲水性蛋白,氨基酸长度510~1353 aa,分子量59.09~152.23 kDa,等电点为5.23~9.69,其中FpPpr3和FpPpr7为稳定蛋白,其他6个蛋白为不稳定蛋白。亚细胞定位预测显示,Ppr蛋白主要位于线粒体。FpPpr1、FpPpr3、FpPpr5、FpPpr6和FpPpr7的3D结构预测形成明显的超螺旋结构。在假禾谷镰孢营养阶段和侵染过程的转录组数据中分析了8个基因表达模式,通过qRT-PCR进行验证,FpPPR1、FpPPR3、FpPPR5在菌丝阶段高表达,FpPPR1、FpPPR5在侵染后期显著下调。本研究结果为进一步研究假禾谷镰孢中PPRs基因的生物学功能奠定基础。

FpStuA参与假禾谷镰孢的产孢和致病性

假禾谷镰孢是一种土传真菌,其引起的小麦茎基腐病已成为威胁我国小麦生产的重要病害。APSES蛋白是真菌中保守存在的一类转录因子,参与多种细胞生理过程。本研究,我们在假禾谷镰孢中鉴定到StuA同源蛋白FpStuA。qRT-PCR分析发现FpStuA在假禾谷镰孢分生孢子和侵染阶段诱导表达。通过PEG介导的原生质体转化方法获得3个FpStuA基因缺失的突变体。与假禾谷镰孢野生型菌株相比,Δfpstua突变体的生长速度明显减慢,气生菌丝减少;分生孢子的产生比野生型减少70%,且Δfpstua突变体分生孢子变短、分隔减少;Δfpstua突变体对大麦叶片、小麦胚芽鞘和小麦根的致病性均显著降低,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成明显减少。综上结果,转录因子FpStuA对假禾谷镰孢的生长、产孢和致病性都非常重要。