α-硫辛酸、酵母铬对热应激绵羊生长性能、血浆生化指标及营养物质消化利用的影响

本试验旨在研究α-硫辛酸(LA)、酵母铬(YC)对热应激绵羊生长性能、血浆生化指标及营养物质消化利用的影响。选择体质健康、年龄和体重相近的绵羊28只,随机分为4组,每组7只羊,分别为对照组(CTL组,饲喂基础饲粮)、LA组(基础饲粮中添加600 mg/kg LA)、YC组(基础饲粮中添加0.5 mg/kg YC)、混合组(MIX组,基础饲粮中添加600 mg/kg LA和0.5 mg/kg YC),试验期50 d。结果表明:各组平均日增重差异不显著(P>0.05);各组营养物质消化利用相关指标差异不显著(P>0.05);与对照组相比,试验组血浆总蛋白(TP)、低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇(CHOL)含量显著降低(P<0.05);YC组胴体重显著增加(P<0.05),YC组屠宰率增加了5.52%(P>0.05)。综上所述,饲粮中添加LA、YC对热应激绵羊的蛋白质及脂肪代谢有一定的影响,还可显著提高热应激绵羊胴体重,屠宰率有所增加,对饲料利用率和体增重的影响不显著。

杜仲叶对绵羊营养物质消化利用、生长性能及屠宰性能的影响

杜仲叶是优质的粗饲料兼具药物活性物质,本试验旨在研究杜仲叶对绵羊营养物质消化利用、生长性能及屠宰性能的影响。选择30只体质健康、年龄和体重相近的绵羊(湖羊),随机分为3组,每组10只羊,分别为对照组(饲喂无杜仲叶的基础饲粮,CTL组)、低水平杜仲叶组(饲粮中含10%的杜仲叶,EUL1组)和高水平杜仲叶组(饲粮中含20%的杜仲叶,EUL2组),进行饲养试验和消化代谢试验。结果表明:饲粮中添加不同水平的杜仲叶对绵羊的末重、增重、采食量、日增重有显著影响(P<0.05),对能量和氮的消化率、沉积率有显著影响(P<0.05),对钙、磷的消化率和沉积率无显著影响(P>0.05),对屠宰率和胴体净肉率有显著影响(P<0.05),对胴体重、净肉重、骨重、骨肉比无显著影响(P>0.05)。由此可见,杜仲叶对绵羊营养物质消化率、利用率及生长性能和屠宰性能等有明显的影响,影响程度与杜仲叶的用量有关。

不同饲养模式对奶牛血液生化指标及激素含量的影响

本试验旨在研究不同饲养模式对奶牛血清生化指标及激素含量的影响。分别选择粗放饲养(EP)、集约化饲养(CP)和不完全集约化饲养(IP)模式下体重、胎次、泌乳日龄相近的健康奶牛各30头,采集血样,检测血液中各项生化指标及代谢相关激素,分析其与奶牛不同饲养模式的关系。结果表明,CP型、IP型奶牛血液中血糖(GLU)、白蛋白(ALB)、非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHB)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、脂多糖(LPS)和组胺(HIS)含量与EP型相比有升高的趋势,而血液中免疫球蛋白(IgG、IgA)、多胺(TA)含量则显著低于EP型(P<0.05);CP型、IP型奶牛血液中胰岛素(INS)、胰岛素/胰高血糖素(INS/GC)、甲状腺素(T3)、生长激素(GH)含量与EP型相比有升高趋势,而血液中胰高血糖素(GC)含量则低于EP型。综上所述,不同饲养模式对奶牛血液生化指标及相关激素分泌有不同程度的影响,其中以CP型饲养模式较好,且CP型>IP型>EP型。

脂多糖对奶山羊肝脏代谢组学的影响

【目的】探寻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)影响奶山羊肝脏营养代谢的特征代谢物(生物标记物),阐明LPS引起肝脏代谢障碍的机制。【方法】选择12—18月龄,体重24—28 kg的关中奶山羊15只,平均分为3组(每组5只),分别为对照组(CTL)、低剂量LPS处理组(LPS-L)和高剂量LPS处理组(LPS-H)。LPS-L和LPS-H分别腹腔注射20、40μg·kg-1 BW的LPS溶液,CTL注射等容量生理盐水。24 h后,LPS-L和LPS-H追加LPS溶液。48 h后,静脉采血,分离血浆和血清,检测血液相关生化指标;然后活体采集肝脏组织,液氮保存。肝脏组织冻干后,用氢核磁共振(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)技术检测肝脏组织代谢物,运用数据库对检测到的代谢物变量进行化合物种类鉴别,再用模式识别方法中的偏最小判别二乘分析法(partia1 1east squares discriminant analysis,PLS-DA)筛选生物标记物。【结果】血清生化指标表明,LPS-L和LPS-H处理的谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)水平较CTL显著升高(P<0.05);甘油三酯(TG)、非酯化脂肪酸(NEFA)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、白蛋白(ALB)和总蛋白(TP)的含量较CTL显著降低(P<0.05)。用1H-NMR技术共检测到69种代谢物变量,包括氨基酸,醇类,糖类及其它代谢产物。PLS-DA分析发现,代谢物变量可将CTL、LPS-L与LPS-H组之间聚类区分,并找到9种组间差异显著的代谢物,这些代谢物主要与氨基酸、脂肪和碳水化合物等代谢途径相关,可作为肝脏在LPS诱导损伤状态下的标志物。【结论】LPS可显著影响奶山羊肝脏营养代谢,1H-NMR代谢组学可以较为全面地检测到肝脏组织的代谢物,准确地筛选出差异代谢物,通过分析差异代谢物的代谢途径,阐明LPS引起肝脏代谢障碍的机理。

奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P<0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P<0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P<0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。

杜仲叶对绵羊脂肪代谢的影响及其机理

为研究杜仲叶对绵羊脂肪代谢和肉品质的影响,本研究随机选择70~80日龄、体重25~30 kg的绵羊(湖羊)30只,平均分为3组,分别为对照组(CTL组,饲粮中不含杜仲叶)、低水平杜仲叶组(EUL1组,饲粮含10%杜仲叶)和高水平杜仲叶组(EUL2组,饲粮含20%杜仲叶),每组10只。预试期15 d,正试期90 d。采集血液,测定血浆脂质代谢分析指标;采集背最长肌,测定营养物质含量;采集肝脏组织,测定脂肪代谢相关酶和核转录因子的mRNA表达水平和蛋白水平。结果表明:1)各组干物质采食量EUL1组>EUL2组>CTL组,组间差异显著(P<0.05)。2)与CTL组相比,EUL2组血浆极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、非酯化脂肪酸(NEFA)含量显著升高(P<0.05),EUL1和EUL2组血浆低密度脂蛋白(LDL)(0.05≤P<0.10)、总胆固醇(TC)(P<0.05)含量降低。3)与CTL组相比,EUL1组肌肉粗蛋白质含量、EUL2组肌肉粗脂肪含量显著升高(P<0.05),EUL1组肌肉剪切力显著减小(P<0.05)。4)与CTL组相比,EUL1组和EUL2组肌肉饱和脂肪酸(SFA)含量略有降低(P>0.05),肌肉不饱和脂肪酸(UFA)含量显著升高(P<0.05),其中,EUL2组肌肉MUFA、PUFA含量及UFA/SFA显著升高(P<0.05)。5)与CTL组相比,杜仲叶能够显著下调肝脏脂肪合成相关酶硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)和核转录因子固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARγ)的mRNA表达水平(P<0.05);显著上调肝脏脂肪酸分解相关酶肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A)、脂蛋白酯酶(LPL)mRNA表达水平显著上调(P<0.05);与CTL组相比,EUL2组肝脏SCD1蛋白水平显著下降(P<0.05)。结果提示,杜仲叶通过调节脂肪合成和分解相关基因的表达,显著影响绵羊脂肪的代谢和肌肉脂肪酸的组成。

德系西门塔尔牛对本地西门塔尔杂交牛的改良效果

为研究德系西门塔尔牛在中原农区改良本地西门塔尔杂交牛的杂交效果,为养牛业生产提供科学理论依据。本研究选择500头商丘本地西杂牛为母本,以德系西门塔尔牛(Fleckvieh)为父本,采用人工授精的方法进行杂交改良。测定杂交一代(F1)和二代(F2)各阶段的生长性能、屠宰性能、产奶性能、乳成分等各项指标。结果表明,杂交后代初生时的各项生长性能指标与西杂牛无明显差异,随着年龄的增长,杂交后代的体尺、体重在一定程度上超过西杂牛;F1和F2代公牛的胴体重、屠宰率、净肉率均不同程度高于LSC牛,牛肉的品级提高;产奶量显著增加(P<0.05),乳品质较高。说明以德系西门塔尔牛为父本改良本地西杂牛不仅可以提高杂交后代的生长性能、屠宰性能,还可以显著改善其泌乳性能,使杂交后代由单一的肉用型转变为乳肉兼用型,提高肉牛养殖的经济效益。

中原经济区奶牛适宜发展模式的调查分析

为深入了解中原经济区的规模化奶牛场特点,采取有针对性的奶业发展措施,通过对中原经济区内河南、河北、山东、山西、安徽等地各种类型规模化奶牛场的调查,在了解规模化奶牛场发展现状的基础上,对奶牛场的饲料供给、粪污处理、适宜规模、经营模式等方面进行了详细分析,提出了规模化奶牛场适宜的发展规模和经营模式,供有关部门制定奶业政策时参考。

不同饲养模式对奶牛健康状况和牛奶品质的影响

为了研究不同饲养模式对奶牛健康状况和奶牛品质的影响,本研究选择三种不同饲养模式下的奶牛各30头,采集血样和乳样,检测免疫相关因子和牛奶品质等指标,分析不同饲养模式对奶牛健康和牛奶品质的影响。结果表明,集约化模式(CF型)的牛奶产量高于不完全集约化模式(IF型)的奶牛,IF型高于粗放饲养模式(EF型)(P>0.05);CF型奶牛的乳蛋白率高于IF型和EF型(P<0.05),EF型乳脂率高于CF型和IF型(P<0.05),EF型牛奶的体细胞数(SCC)显著高于CF型和IF型(P<0.05)。EF型奶牛血液相关免疫指标IgA、IgG、TNF-α、IL-1β和IL-6等均显著高于CF型和IF型(P<0.05)。可以得出,EF型奶牛的牛奶产量、牛奶品质和健康状况均低于CF型和IF型。

奶牛乳腺上皮细胞中SCAP和SREBP1蛋白调控SCD基因表达的作用研究

旨在研究奶牛乳腺上皮细胞中固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)对固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)调控的硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)表达的影响。培养奶牛乳腺上皮细胞,在细胞中转染奶牛SCD基因启动子载体,同时转染SREBP1和SCAP真核表达载体作为处理,采用双荧光素酶报告基因系统检测转染SREBP1和SCAP对SCD基因启动子活性的影响;采用免疫荧光技术观察SREBP1在细胞核的表达,采用荧光定量PCR检测SCD基因mRNA的表达。结果表明,与转染pcDNA3.1载体的对照组相比,转染SCAP对SCD启动子活性无显著影响;转染SREBP1和共转染SCAP/SREBP1极显著增加SCD基因启动子活性值(P<0.01),并且SCAP的转染剂量与SCD的启动子活性值之间具有极显著的量效关系(P<0.01);在乳腺上皮细胞中转染SCAP后,能够增强SREBP1在细胞核的表达;细胞转染SREBP1和共转染SCAP/SREBP1后,SCD基因mRNA的表达分别显著上调1.23倍和1.54倍(P<0.05)。本研究表明,奶牛SCAP可以增加SREBP1蛋白在细胞核中的表达,促进对SCD基因的转录激活作用。

沉默SCAP基因对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响

旨在探究沉默固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响,本研究构建了SCAP短发夹RNA慢病毒载体,包装感染奶牛乳腺上皮细胞,通过在培养基中添加嘌呤霉素筛选获得SCAP基因沉默稳转细胞株,采用Real-time PCR和Western blot观察基因沉默细胞株中SCAP基因和蛋白的表达,尼罗河红和油红O染色脂滴检测SCAP基因沉默及SCAP质粒瞬时转染对细胞脂滴形成的影响。结果表明,本研究成功构建了奶牛SCAP基因沉默慢病毒重组载体,感染细胞后经过5 mg·L^(-1)嘌呤霉素筛选得到SCAP基因沉默稳转细胞株。基因检测发现,各个沉默细胞株的SCAP基因表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,RNAi-SCAP3细胞中的SCAP蛋白表达降低为对照组的0.49倍(P<0.05),脂代谢基因SCD和FAS表达也显著下降(P<0.05)。脂滴染色发现,RNAi-SCAP3沉默细胞株的脂滴含量显著低于对照组细胞(P<0.01),脂滴直径≤2.0μm的小脂滴个数增多,而直径≥2.5μm的大脂滴个数减少;将SCAP真核表达载体瞬时转染RNAi-SCAP3细胞株后发现,SCAP基因的过表达显著减少了细胞中小脂滴比例而增加了大脂滴比例(P<0.05)。本研究成功构建了SCAP基因沉默稳转细胞株,发现SCAP的表达影响了细胞脂滴直径的大小。

基于Spyligase技术的禽流感血凝素H5HA10多聚体抗原的高效制备

利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促溶性标签的H5HA10重组表达载体,同时构建了1种含有Cherry标签的Spyligase重组表达载体。将这10种重组载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,筛选出可以显著促进H5HA10重组蛋白表达的融合标签ArsC。通过优化诱导表达条件,在大量诱导表达、纯化后成功获得了高纯度的H5HA10和Spyligase重组蛋白,最终在PCT缓冲体系中, Spyligase促使H5HA10重组蛋白的蛋白聚合,形成了环化单体、三聚体、六聚体以及九聚体。

使用phiC31整合酶构建奶牛INSIG1基因乳腺恒定表达细胞系

为了使用phiC31整合酶建立奶牛胰岛素诱导基因1(INSIG1)的稳定表达乳腺细胞系,首先从奶牛乳腺组织中克隆得到INSIG1基因的编码区,然后将克隆片段与phiC31载体进行BamHⅠ和KpnⅠ双酶切构建INSIG1-C31真核表达质粒;将其与phiC31整合酶质粒共同转染到小鼠乳腺细胞中,采用嘌呤霉素筛选细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达,PCR鉴定细胞基因组中INSIG1基因的表达,荧光定量PCR检测细胞中INSIG1基因的表达。结果表明,试验成功构建INSIG1-C31真核载体,与phiC31整合酶共转染小鼠乳腺细胞,经过8mg/L嘌呤霉素筛选后获得完全表达绿色荧光蛋白的乳腺细胞系;对细胞系鉴定表明INSIG1基因已经整合到细胞基因组中,与对照组相比,INSIG1基因的mRNA表达丰度增加了597.98倍(P<0.001)。本研究获得了稳定表达奶牛INSIG1基因的乳腺细胞系,为深入研究INSIG1基因功能打下基础。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白可溶性原核表达及免疫原性分析

为在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在VP2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,筛选出显著促进VP2-LS3蛋白可溶性表达的融合标签,并进行大量诱导表达、纯化。纯化得到的VP2-LS3重组蛋白分别进行TEV酶酶切、电镜观察分析及免疫家兔,并对获得的兔抗VP2血清进行Western blot和间接ELISA分析。结果显示,与其他6个标签相比,MBP标签促进VP2-LS3蛋白的可溶性表达具有显著性,可溶性表达水平达到69.5%;TEV酶可以把His6-MBP标签蛋白与VP2-LS3蛋白分开,获得高纯度的VP2-LS3蛋白;镜检显示形成了LS3蛋白笼纳米颗粒;Western blot结果表明,表达的VP2-LS3重组蛋白可与兔抗血清发生特异性反应,而不与阴性对照血清发生反应;间接ELISA检测制备的兔抗VP2血清效价达到1∶12 800。本研究获得了高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒,为传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程疫苗的研发奠定基础。

奶牛SCAP基因的克隆,表达定位及对FASN基因启动子的转录调控

固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（srebpcieavage activating protein,SCAP）是细胞脂肪合成酶的表达调控因子。本研究旨在肝脏L02细胞中研究SCAP对FASN基因启动子的转录调控作用,有助于进一步明确SCAP/SREBP1对于靶基因的转录调控机制。本研究以荷斯坦奶牛组织c DNA为模板,克隆SCAP基因的编码序列,构建pc DNA3.1-SCAP表达载体,将SCAP表达载体转染L02肝脏细胞,采用荧光定量PCR检测SCAP基因m RNA在24 h、48 h、72 h的表达情况;采用免疫荧光的方法对SCAP标记,激光共聚焦观察SCAP蛋白的亚细胞定位;构建FASN基因启动子载体,转染至肝脏细胞,并分别转染pc DNA3.1-SREBP1和pc DNA3.1-SCAP作为处理,荧光素酶报告基因系统分析对FASN启动子活性的影响。结果发现克隆得到SCAP的PCR产物为3 836 bp的片段,通过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SCAP表达载体,经酶切和测序鉴定正确;将pc DNA3.1-SCAP载体转染肝脏细胞培养24 h、48 h、72 h后,Real-time PCR检测发现与对照组相比,48 h时细胞中SCAP基因m RNA的表达倍数增加了21倍（p〈0.001）;激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SCAP呈红色,二者融合后发现SCAP定位于细胞质;启动子活性检测发现,与对照组相比,SREBP1质粒处理的细胞FASN启动子活性增加了4.1倍（p〈0.001）,而SCAP和SREBP1共同处理细胞FASN启动子活性极显著增加了7.4倍（p〈0.000 1）。试验克隆构建奶牛SCAP基因表达载体,亚细胞定位SCAP蛋白主要位于肝脏细胞质中,表明SCAP可以通过结合SREBP1促进FASN基因启动子的转录。