鸡杆菌河南分离株的分子进化分析

【目的】确定鸡杆菌河南分离株的具体种属和进化地位。【方法】以9株鸡杆菌河南分离株为研究对象,根据GenBank上登录的相关序列,针对鸡杆菌3个管家基因rpoB、infB和atpD设计引物,并进行PCR扩增、克隆和序列测定分析;将9株鸡杆菌的3个管家基因部分核苷酸序列,与已知的鸡杆菌属和巴氏杆菌科其他属相关参考株的相应基因序列进行比较分析并构建进化树。【结果】扩增出rpoBi、nfB和atpD3个管家基因部分序列,长度分别为566,531和1 441 bp,将测序结果登陆到GenBank。鸡杆菌分离株间的同源性分别为98.3%~100%（rpoB）、90.5%~100%（infB）和98.3%~100%（atpD）;分离株与国外鸭源鸡杆菌分离株间的同源性分别为97.1%~98.5%（rpoB）8、5.2%~93.2%（infB）和98.3%~98.8%（atpD）;分离株与国外鸡杆菌属其他种的同源性分别为84.3%~86.8%（rpoB）,83.1%~86.7%（infB）;鸡杆菌分离株与巴氏杆菌科其他代表属的同源性分别为77.4%~79.3%（rpoB）、78.2%~79.7%（infB）和83.5%~84.1%（atpD）。遗传进化分析显示,9株鸡杆菌河南分离株与鸭源鸡杆菌处于同一大分支之中。【结论】9株鸡杆菌河南分离株均为鸭源鸡杆菌。

稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体细胞株的筛选与应用

研制抗羊种布鲁菌脂多糖抗原的单克隆抗体,并应用其建立检测布病的双夹心ELISA方法。本研究采用热酚水法提纯羊种布鲁菌(16M菌株)的脂多糖抗原,并经SDS-PAGE鉴定。用脂多糖和灭活的羊种布鲁菌16M作为免疫抗原,交替免疫6～8周龄BALB/c雌鼠,第1次免疫用羊种布鲁菌标准菌16M全菌加等量弗氏完全佐剂;第2次免疫用脂多糖加等量弗氏不完全佐剂。将脂多糖作为包被抗原建立间接ELISA方法,筛选针对抗羊种布鲁菌(16M菌株)脂多糖的单克隆抗体杂交瘤细胞株。筛选出3株能稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5H3、6B8和3H7,细胞培养上清的ELISA效价在1∶1 000～1∶5 000,小鼠腹水单克隆抗体ELISA效价在1∶10 000～1∶160 000;抗体亚类鉴定表明:5H3、6B8属于IgM亚类,3H7属于IgG3亚类;特异性试验结果显示:3株杂交瘤细胞分泌的抗体不与大肠杆菌O157裂解抗原、鸡白痢沙门氏菌裂解抗原、鸭源鸡杆菌脂多糖抗原以及福氏志贺菌裂解抗原反应,仅与灭活的羊种布鲁菌(16M)发生反应。布鲁菌虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测结果显示,获得的单抗可与标准检测抗原形成明显的颗粒凝集物和伞状凝集物。利用所建立的单克隆抗体细胞株,建立了一种检测布鲁菌的双夹心间接ELISA方法,并进行了特异性和敏感性检测。对模拟样品和临床样品进行检测,准确性均很高。

河南省猪场蚊虫中Ⅰ、Ⅲ型乙型脑炎病毒的分离及鉴定

用Vero细胞对2010年河南省采集的猪舍蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙型脑炎病毒(JEV)进行分子生物学鉴定,并对其PrM基因进行克隆、测序及病毒进化分析。结果显示,从采集的蚊虫标本中分离到1株基因Ⅰ型JEV(HN10-1)和1株基因Ⅲ型JEV(HN10-2)。结果表明,河南省同时存在Ⅰ、Ⅲ2种基因型JEV的传播和流行。

河南及山西省21株鸡杆菌分离株16S rRNA基因序列分析

对21株分离自河南及山西地区的鸡杆菌的16SrRNA基因序列进行研究,以此分析分离株的进化关系并确定其在鸡杆菌属中所属的具体种。采用PCR方法扩增其16SrRNA基因序列,然后克隆测序。用DNAStar软件对21个菌株的序列及GenBank中已公布的鸡杆菌属相关菌株序列进行同源性比较,结果发现21株分离株之间的核苷酸序列同源性为96.0%～100%,同鸭源鸡杆菌F279(Gallibacterium anatis F279)(AF228002)的同源性为95.3%～99.3%,同输卵管炎鸡杆菌F150(Gallibacterium salpingitidis F150)(EU424000)的同源性为88.3%～91.5%,同虎皮鹦鹉鸡杆菌F450(Gallibacterium melopsittaci F450)(EU339196)的同源性为90.3%～93.3%,同海藻糖发酵鸡杆菌52-S3-90(Gallibacterium trehalosifermentans 52-S3-90)(EU339199)的同源性为88.2%～91.4%,同多杀性巴氏杆菌CCUG 179(P.multocida CCUG 17977)(AF294411)的同源性为85.5%～88.8%,对21株细菌的序列同以上菌株的16SrRNA基因序列进行遗传进化树分析,显示21株细菌同鸭源鸡杆菌F279(AF228002)构成一个单独的大分支。结果表明,所有分离株均属于鸭源鸡杆菌,首次大量报道了来源于河南、山西省不同地区的鸡杆菌的16SrRNA基因序列,为鸡杆菌分类的研究提供了参考。