不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析

【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现特殊的反应特性,单抗不能抑制3#和12#的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。HA蛋白氨基酸序列分析表明,3#和12#分离株145位氨基酸发生漂变(S→N),导致与单抗的血凝抑制反应特性丢失,说明该位点(S145)为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,是血凝抑制抗体结合位点。S145N的漂变导致在145—147位氨基酸多出一个糖基化位点NGT,可能是分离株毒力增强的原因。【结论】本研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒呈现变异趋势,出现了有致病力和抗原性变异流行毒株。S145为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,但有该位点漂变导致的抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用,对该病的防控提出了新的挑战。

H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究

对1998—2002年间在河南省豫北地区分离到的5株H9N2亚型禽流感病毒的抗原性变异进行了研究。经HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验及攻毒保护试验证明，5株H9N2亚型间已经发生了抗原性漂移。98A5和99S毒株间的保护力接近100％，HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验的相关性均在0．74以上。表明2毒株间的抗原性相近；用00Y毒株攻击其他4株免疫的鸡，其保护率仅为60％～80％；而02Y株对除00Y株外的4株的免疫保护率分别为60％、75％、80％、100％，与分离年代呈负相关性，HI、鸡胚中和试验、细胞中和试验也取得类似结果，说明2000年后的毒株间已发生抗原性变异。

H9N2亚型禽流感病毒不同流行株抗原性和免疫原性的比较研究

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,采用交叉HI试验、细胞中和试验和攻毒保护试验对1998-2008年间分离到的25株H9N2AIV的抗原性和免疫原性进行了研究。结果显示,依据不同毒株与Hp株免疫产生HI抗体的结果可将25个毒株分为3类,第1类HI效价4.0log2～5.0log2的为12#、17#、18#;第2类毒株HI效价6.0log2～7.0log2的为2#、21#、5#、22#、11#、25#、15#、16#;其余毒株的HI效价为7.0log2～8.0log2。这证实不同H9N2AIV流行毒株间的抗原性有差异。选取代表性的8株H9N2AIV毒株进行中和试验,结果显示其抗原相关性在0.42～0.84。除了3#与14#、11#与17#的抗原性有明显差异外(相关性R值分别为0.46、0.42),其余毒株间的抗原性无明显差异或仅有较小的差异。抗原性不同的H9N2AIV株对Hp株免疫鸡的攻毒保护试验显示Hp株能够对抗原性有差异的攻毒株(10#、12#、17#)产生有效保护(9/10),联合攻毒试验结果显示Hp毒株免疫鸡可抗其他毒株(9#+15#和16#+17#)的联合攻击,保护率9/10以上。以上结果显示,H9N2AIV Hp株与多数流行毒株间在免疫原性上无明显差异,H9N2AIV多数流行毒株间的免疫原性没有发生根本改变。

2009-2010年河南周边地区禽病流行状况简析

近年来，禽病呈现多发和复杂态势，给养禽业造成很大损失。笔者针对河南省周边地区2009—2010年禽病流行状况进行简要分析。谨供参考。

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定。结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现。S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用。这提示该病的防控面临着新的挑战。

鸡传染性支气管炎病毒河南流行毒株S1基因的变异分析

经鸡胚接种、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、气管环培养等方法从河南不同地区发病鸡群中先后共分离、鉴定出7株鸡传染性支气管炎病毒(IBV).应用RT-PCR方法对7株病毒以及IBVH120疫苗株的S1基因全序列进行扩增,并对其进行克隆测序及序列分析.结果显示:8株IBV的S1基因全长分为4类,分别是1 632、1 6201、617和1 611 bp;序列相互之间存在多位点变异,同时存在型特异性的插入和缺失;其S蛋白裂解位点序列模式有HRRRR、RRFRR和RRSRR 3种;同源性及遗传进化分析显示Jin-13为呼吸型毒株,YI为ArkDPI型肾型毒株,HN/SG株与国内其他肾型分离株亲缘关系均较远;河南肾型分离株HN/HL、XP/1/09、XP/3、WZL与山东肾型分离株之间的同源性较高且其亲缘关系最近,而与河南HN99株的亲缘关系较远.说明河南地区存在不同的IBV流行毒株,这些流行毒株在主要保护性抗原蛋白S1基因上发生了一定的变异.

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的进化分析

利用RT—PCR方法，扩增了1998-2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因，对其进行了序列测定和进化分析。序列分析表明，9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp，编码217个氨基酸，其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95．4％～99．8％和93．6％～100％；9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失；进化分析表明，9株AIV属于A群，且形成一个独立分支，在该分支中，只有Ck／HN／A3／98株属于Ck／HK／Y280／97-like亚类，且与Ck／BJ／8／98的进化关系最近，其余8株属于Ck／SH／F／98-like亚类，说明Ck／SH／F／98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在。NS1基因的进化及其编码产物的特性分析，为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础。

RT-PCR检测禽传染性支气管炎病毒

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ，分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０、２２８、６０２ｂｐ的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、Ｃｏｎｎ、Ｇｒａｙ、Ｔ、Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒、上毒、云毒、ＨＫ、１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ，结果除Ｈｏｌｔｅ株和２个分离株（宜毒、云毒）外，其余均成功地扩增出６００ｂｐ的片段。用１．７、０．２、０．６ｋｂ３对引物对６个ＩＢＶ毒株和６个分离株的含毒尿囊液在相同和不同条件下进行ＲＴ－ＰＣＲ，结果３对引物分别扩增出３、５、９株ＩＢＶ，同时可将不同血清型的１２个ＩＢＶ株分成６种基因型。将ＩＢＶ分离株ＨＫ与标准株Ｍ４１经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和Ｈｉｎｄ酶切、ＲＦＬＰ分析，表明属同一马萨诸塞血清型。３株ＩＢＶ（Ｈ１２０，ＨＫ，Ｍ４１）在鸡胚中繁殖，ＰＣＲ最早检出的时间为２０～２４ｈ。ＲＴ－ＰＣＲ提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒的新方法。

河南IBV肾变型地方分离株的分型研究

在气管环上进行交叉中和试验,结果显示河南分离的肾变型宜毒株与除T株以外的其余标准血清型毒株(M41、Holte、Arka、Conn、Gray)均有不同程度的交叉,但与Ark株相关性最大,为25%。将除Holte株以外的5株标准株和宜株的0.6kb扩增产物,用三种限制性内切酶AluⅠ、TaqⅠ和AfaⅠ进行酶切,RFLP分析可分为三种模式,宜株与Ark株、Gray株、CoNn株属同一模式,AluⅠ和AfaⅠ酶切阳性而TaqⅠ酶切阴性。另AluⅠ、TaqⅠ、AfaⅠ酶切均阳性的M41模式和TaqⅠ、AfaⅠ酶切阳性而AluⅠ酶切阴性的T株模式。将地方株宜株的0.6kb扩增片段进行测序并与标准株Ark株、Gray株、Conn株、Holte株和M41株的相应序列进行分析比较,核苷酸、氨基酸同源性的分析显示,宜毒株与同一酶切类型的Ark＿1529＿29株同源性最高,核苷酸同源性为93%,氨基酸同源性为91.6%。推测宜株可能是Ark血清型毒株的变异株。宜株与Ark株在血清学分型与基因分型上的一致性,表明这两种分型方法之间有一定的内在联系。

禽偏肺病毒通用型EvaGreen荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立各亚型禽偏肺病毒(aMPV)的快速检测方法,本研究对aMPV 4个亚型的核苷酸序列比对分析,针对aMPV N基因的保守区域设计了一对特异性引物,通过条件优化,建立了检测aMPV各亚型的通用型EvaGreen荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法在模板为10~3拷贝/μL～10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;检测下限为10~3拷贝/μL,敏感性为常规RT-PCR的10倍。与其它常见禽类病毒无交叉反应;组内重复试验和组间重复试验的变异系数分别为0.89%～1.34%和2.01%～3.29%,具有较好的重复性。利用所建立的方法对河南省部分地区鸡场送检病鸡样品进行检测,结果显示被检地区鸡场的aMPV的平均阳性率为46.66%,与普通RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的EvaGreen荧光定量RT-PCR方法可以用于aMPV的检测,为aMPV感染的流行病学调查提供了可行方法。

鹦鹉感染禽波纳病毒病例

笔者在临床中遇到一例绿翅金刚鹦鹉感染ABV 的疑似病例,经过临床流行病学、剖检变化和RT - PCR 检测ABV 核酸,证实该鹦鹉感染禽波纳病毒(ABV)。报告如下。

目前禽病的防治思路

1鸡病 1.1表现 鸡的局部性疫病增加，主要表现在以下几个方面： 1.1.1肉仔鸡呼吸道病增加，剖检常见气囊炎、腹膜炎、肾脏肿胀甚至坏死、腺胃乳头基部或尖部出血。死亡率5％-50％不等。按照大肠杆菌病、新城疫、霉形体病等治疗效果不佳。病程较长，易反复。

目前家禽呼吸道病流行状况分析与对策

呼吸道病一直是家禽养殖业的棘手问题．在全国普遍发生．几乎所有的养殖场都发生过．一部分养殖场深受其害导致严重的亏损。呼吸道病的非典型病例诊断较为困难．而典型的呼吸道病死亡率较高、药物应用效果不佳。家禽呼吸道病一般为混合感染．每年的流行特点都有差异。笔者根据临床防治调查研究．就目前家禽呼吸道病流行状况进行分析．并提出相应的解决方案．仅供参考。

鸭乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、特异的鸭乙型肝炎病毒(DHBV)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,设计一对引物扩增DHBV基因组,将其克隆到pMD-18-T载体上,然后以该重组质粒为模板,选择DHBV S基因保守序列设计一对定量PCR引物,构建标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯在鸭体内对DHBV-DNA复制的抑制效果。结果表明:该方法能特异性检测到DHBV;相关系数为1.00,扩增效率为105%;敏感度高,最低检测限为70个拷贝。拉米夫定和阿德福韦酯对DHBV感染后鸭外周血DHBV-DNA的复制均有很好的抑制效果,但停药后会出现轻度"反跳"现象。建立的DHBV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,可用于抗HBV药物的评价。

非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体

利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。

银加强金标免疫技术在鸡传染性支气管炎病毒检测中的应用

采用胶体金标记纯化的羊抗鼠IgG,建立了一种对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)进行检测的银加强金标免疫技术(SECGA).先将抗原点样于硝酸纤维素膜(NCM)中央,封闭后浸于40×稀释的IBV单抗中作用10min,洗涤后再浸于体积比为1:4稀释的金标羊抗鼠IgG溶液中作用1h,银染10min后观察,在膜上出现灰黑斑点的为阳性结果,反之,不出现斑点为阴性结果.SECGA对IB抗原最低测量值为0.703ng·点-1(约2μL),对含毒尿囊液的最低检测为102..9EID50.结果表明,IB VM41毒株在鸡胚中繁殖时以36～54h检测含毒量最高;SPF鸡感染3d后可从气管粘液中检出病毒.SECGA检测抗原可用于IBV早期检测,具有群特异性,快速、敏感、简便,不需特殊设备,结果易判定等优点,尤适于基层实验室或现场应用.