食管癌的免疫治疗研究进展

食管癌不论是在国内,还是在国际上均为最常见的恶性肿瘤之一。食管癌因为其早期往往可能无任何明显症状,患者发现时已经进入中晚期,导致总体预后较差。临床上,食管癌的治疗方式因受浸润程度、发生位置、病理分型、有无转移、科技技术发展、医师和医疗机构的经验,以及患者身体条件、接受程度等因素的影响,使其治疗方式千差万别。随着各个领域得不断进步,近几年,免疫检查点抑制剂作为一种新的食管癌治疗手段,取得了显著的疗效。现本文查阅了近期发表的食管癌免疫治疗相关实验及文献,围绕食管癌的免疫研究治疗进展进行综述。

原代人气道基底细胞的分离与培养

目的:构建成熟的原代人气道基底细胞的分离、培养与传代体系。方法:从废弃的供肺或切除的病肺中分离出气管或较大的支气管;采用蛋白酶、DNA酶消化,搔刮气管或支气管内膜分离基底细胞,接种于Purecol包被的培养瓶,Epi XBase培养基培养、传代;免疫荧光染色法鉴定TRP63+KRT5+基底细胞;比较健康捐赠者和病肺来源的原代气道基底细胞活性。结果:成功分离培养38株人原代人气道基底细胞。标本来源宿主中男性21名、女性17名,年龄中位数59岁(2,77)。其中健康捐献者12例,慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者11例,特发性肺纤维化(IPF)患者9例,系统性硬化肺纤维化3例,朗罕氏细胞增生症1例,尘肺病1例,特发性肺高压1例。人气道基底细胞镜下呈多边形,成片连接,形似蜂巢,细胞间连接紧密。成熟细胞形态较均一,细胞核大,胞浆内可见颗粒。免疫荧光染色证实为TRP63+KRT5+基底细胞。38株人气道基底细胞第1代细胞活性为81.25%±0.12%。健康捐献者来源(12例)与病肺来源(26例)的细胞株活性无明显统计学差异。结论:本研究中,分离和培养人气道基底细胞成功率高,细胞纯度高,细胞活性也较高,为人气道基底细胞体外试验提供了技术基础。健康捐献者来源与病肺来源的第1代细胞活性无明显统计学差异。

利用人气道基底细胞体外构建类气管球

目的:利用人气道基底细胞体外培养类气管球。方法:利用河南省人民医院肺移植术中弃用的供肺分离并培养人气道基底细胞、肺成纤维细胞。将气道基底细胞和肺成纤维细胞1∶1混合,重悬于基质胶,用EpiX Base培养基培养,以单独培养的基底细胞或肺成纤维细胞为对照。观察是否形成类气管球及不同时间点类气管球的形态,并采用免疫荧光染色明确成熟类气管球的细胞成分。将气道基底细胞老年株或青年株分别和人肺成纤维细胞老年株或青年株联合培养,观察形成的类气管球的差别。结果:气道基底细胞单独培养或与肺成纤维细胞联合培养均可见类气管球形成,肺成纤维细胞单独培养无类气管球形成。类气管球在镜下呈球形,随着培养时间延长球体增大,14~21 d达峰值。免疫荧光染色可见KRT5+P63+基底细胞分布于类气管球球体表面,FOXJ1+纤毛细胞和MUC+分泌细胞分布在管腔内部。培养第20天,与基底细胞青年株相比,基底细胞老年株与成纤维细胞联合培养所形成的类气管球直径更大,数量更多。结论:人气道基底细胞体外培养可形成类气管球,人肺成纤维细胞和气道基底细胞联合培养可促进类气管球的形成。来自老年宿主的基底细胞体外培养所形成的类气管球的直径大于青年宿主且数量更多。

脑和肌肉ARNT样蛋白1水平在食管鳞癌组织的表达及其临床意义

目的:探讨脑和肌肉ARNT样蛋白1(BMAL1)在食管癌组织中表达水平及其与食管癌患者临床病理特征和预后的关系。方法:选取2021年2月至2023年2月河南省人民医院手术切除的77例食管癌组织和癌旁组织作为研究对象,采用免疫组织化学分析两组组织中BMAL1蛋白表达水平;分析BMAL1表达水平与临床病理特征的关系。以BMAL1表达平均值作为阈值,分为高表达组和低表达组,分析BMAL1表达与预后的关系。组间计量数据比较采用t检验。结果:癌旁组织BMAL1蛋白和mRNA表达水平(1.69±0.28、2.42±0.29)明显低于食管癌组织中BMAL1蛋白和mRNA表达水平(0.87±0.10、1.10±0.28),差异有统计学意义(t=24.280、28.750,P<0.05)。不同年龄、性别和肿瘤大小患者BMAL1蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ期患者BMAL1蛋白表达水平(1.87±0.21)明显高于Ⅰ~Ⅱ期患者(1.44±0.12),差异有统计学意义(t=10.520,P<0.05)。低分化患者BMAL1蛋白表达水平(1.87±0.21)明显高于中高分化患者(1.44±0.12),差异有统计学意义(t=16.710,P<0.05)。淋巴结转移患者BMAL1蛋白表达水平(1.84±0.24)明显高于未淋巴结转移患者(1.46±0.16),差异有统计学意义(t=7.392,P<0.05)。高表达组和低表达组患者3年生存率分别为37.84%(14/37)和62.50%(25/40),高表达患者术后生存率(37.84%)明显低于低表达组(62.50%),差异有统计学意义(Log-rank=10.342,P<0.05)。高表达组患者细胞核增殖抗原(Ki-67)表达阳性率[86.49%(32/37)]明显高于低表达组患者阳性率[42.50%(17/40)],差异有统计学意义(χ^(2)=7.569,P<0.05)。BMAL1表达水平、分化程度、TNM分期和淋巴结转移等特征与食管癌患者预后密切相关(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示,BMAL1高表达水平是食管癌患者预后的独立危险因素[风险比(HR)=1.398,95%可信区间(CI):1.123~1.409,P<0.01]。结论:BMAL1在食管癌组织中呈高表达,与患者临床TNM分期、分化程度、淋巴结转移和Ki-67表达水平等临床病理特征和标志物呈正相关,BMAL1表达越高患者预后越差。

扩大N1区淋巴结清扫对Ⅱ~ⅢA期非小细胞肺癌患者远期疗效和预后的影响

目的探讨扩大N1区淋巴结清扫对Ⅱ~ⅢA期非小细胞肺癌患者远期疗效和预后的影响。方法选取2019年1月至2021年12月河南省人民医院收治的310例Ⅱ~ⅢA期非小细胞肺癌患者作为研究对象, 根据是否在标准化肺癌根治术中扩大N1区淋巴结清扫将患者分为对照组和干预组。术后进行铂类为主的二联辅助化疗4个疗程。随访24个月, 分析两组患者局部复发、无疾病进展生存时间、手术时间、失血量、手术并发症等指标差异。局部复发率采用χ2检验;计量数据比较采用t检验, 生存时间比较采用Logrank检验。结果对照组患者N1区淋巴结清扫数量[(41.17±7.42)个]明显低于干预组患者淋巴结数量[(54.96±7.97)个], 差异有统计学意义(t=14.940, P<0.05)。对照组患者局部发生率(30/139, 21.58%)明显高于干预组患者(12/139, 8.63%), 差异有统计学意义(χ2=6.587, P<0.05)。对照组患者无疾病进展生存时间(9.15个月)明显低于干预组患者(6.14个月), 差异有统计学意义(Logrank=4.581, P<0.05)。对照组和干预组患者手术时间[(143.50±15.15)、(140.37±11.95) min]比较, 差异无统计学意义(t=1.912, P>0.05)。对照组和干预组患者失血量[(115.71±23.85)、(114.17±16.87) ml]比较, 差异无统计学意义(t=0.618, P>0.05)。两组患者并发症发生率比较[12.26%(19/155)和12.90%(20/155), χ2=0.018, P>0.05], 差异无统计学意义。结论扩大N1区淋巴结清扫可显著降低Ⅱ~ⅢA期非小细胞肺癌患者局部复发率, 延长无疾病进展生存时间。

长链非编码RNA UCA1通过微小RNA-203对食管癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA) UCA1通过微小RNA(miRNA, miR)-203对食管癌细胞增殖, 凋亡和侵袭的影响。方法选取河南省人民医院2021年2月到2022年1月手术切除的142例食管癌和癌旁组织, 采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析lncRNA UCA1和miR-203表达水平;乳腺癌MCF-7细胞系随机分为lncRNA对照组、短发卡RNA(shRNA) UCA1组、miRNA对照组和miR-203组。采用蛋白质印迹法(Western blot)、流式细胞术和Transwell实验分析不同处理的细胞增殖、凋亡和转移情况。荧光素酶基因报告实验检测lncRNA UCA1和miR-203的关系。蛋白质印迹法(Western blot)分析增殖、凋亡和转移蛋白表达水平。组间计量资料比较采用t检验。结果癌旁组织lncRNA UCA1表达水平(0.89±0.14)低于食管癌组织(2.71±0.20), 差异有统计学意义(t=4.661, P<0.05);癌旁组织miR-203表达水平(1.18±0.16)高于乳腺癌组织miR-203表达水平(0.34±0.11), 差异有统计学意义(t=3.917, P<0.05)。lncRNA对照组细胞48 h吸光度(A)值(2.19±0.21)高于shRNA UCA1组细胞48 hA值(1.47±0.10), 差异有统计学意义(t=3.198, P<0.05)。miRNA对照组细胞48 hA值(2.28±0.24)高于miR-203组细胞48 hA值(1.33±0.17), 差异有统计学意义(t=3.139, P<0.05)。lncRNA对照组细胞凋亡比例[(6.81±0.89)%]低于shRNA UCA1组细胞[(22.09±4.12)%], 差异有统计学意义(t=4.871, P<0.05)。miRNA对照组细胞凋亡比例[(6.09±0.82)%]低于miR-203组细胞[(27.09±3.81)%], 差异有统计学意义(t=5.557, P<0.05)。lncRNA对照组细胞侵袭数量[(132.44±11.82)个]高于shRNA UCA1组细胞侵袭数量[(68.29±6.82)个], 差异有统计学意义(t=5.719, P<0.05)。miRNA对照组细胞侵袭数量[(126.98±10.54)个]高于miR-203组细胞侵袭数量[(74.29±8.71)个], 差异有统计学意义(t=6.209, P<0.05)。lncRNA UCA1有miR-203的结合位点, 起着海绵作用。lncRNA对照组细胞MAP3K1、IRS-1和RGS7 mRNA表达水平(1.39±0.21、1.22±0.17、1.10±0.15)明显高于shRNA UCA1组细胞(0.76±0.19、0.71±0.20、0.49±0.17), 差异有统计学意义(t=3.191、3.018、3.381, P<0.05)。结论 lncRNA UCA1在食管癌中高表达, 通过结合miR-203, 调控着食管癌细胞增殖、凋亡和侵袭过程。

微小RNA-203在食管癌中的表达水平及其临床意义

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-203在食管癌中的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系。方法选取河南省人民医院2016年1月到2020年1月收集的109例食管癌和癌旁组织作为标本,采用转录组学和荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析癌旁组织和食管癌中差异表达miRNA;选择差异表达显著的miR-203分析其表达水平与食管癌患者临床病理特征和预后的关系;蛋白质印迹法(Western blot)分析食管癌组织细胞增殖抗原(Ki-67)表达水平;分析miR-203水平与Ki-67的关系。计量数据比较采用t检验,相关性采用Pearson相关系数法。结果转录组学技术筛选癌旁组织和食管癌组织中差异表达miRNA 25个,其中miR-203差异最为显著,因此本研究选择miR-203作为研究靶点。癌旁组织中miR-203表达水平(1.09±0.11)明显高于食管癌组织miR-203表达水平(0.37±0.09),差异有统计学意义(t=3.109,P<0.05)。中高分化患者食管癌组织miR-203表达水平(1.21±0.14)明显高于低分化患者食管癌miR-203表达水平(0.61±0.13),差异有统计学意义(t=3.331,P<0.05)。Ⅰ~Ⅱ期患者食管癌组织miR-203表达水平(1.18±0.17)明显高于Ⅲ~Ⅳ期患者食管癌组织miR-203表达水平(0.53±0.12),差异有统计学意义(t=3.973,P<0.05)。无淋巴结转移患者食管癌组织miR-203表达水平(1.24±0.15)明显高于淋巴结转移患者食管癌组织miR-203表达水平(0.42±0.13),差异有统计学意义(t=3.973,P<0.05)。miR-203高表达患者中位生存时间为70.43个月[95%可信区间(CI):60.54~81.76个月]明显高于miR-203低表达组患者48.21个月(95%CI:40.48~61.69个月),差异有统计学意义(Log-Rank=3.905,P<0.05)。miR-203高表达患者术后3年生存率[58.33%(28/48)]高于低表达组患者术后3年生存率[32.79%(20/61)],差异有统计学意义(Log-Rank=4.210,P<0.05)。miR-203高表达患者食管癌组织Ki-67表达水平(1.29±0.16)明显低于miR-203低表达患者(3.21±0.31),差异有统计学意义(t=5.116,P<0.05)。多因素Logistic回归显示食管癌患者3年生存率与临床分期、分化程度、临床分期、淋巴结转移、miR-203和Ki-67表达呈相关性[比值比(OR)=1.698、1.302、1.098、1.243、1.549、1.792,P<0.05]。结论miR-203在食管癌呈低表达,与患者临床病理特征和预后及其食管癌细胞增殖密切相关。

微小RNA-203靶向RGS17蛋白对食管癌细胞增殖、周期和迁移的影响

目的探讨微小RNA(miR)-203靶向RGS17蛋白对食管癌细胞增殖、周期和迁移的影响。方法采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析正常食管上皮细胞HEEC、食管癌细胞TE-8、EC9706和EC-11中miR-203表达水平。将对数生长期食管癌细胞EC9706分为对照组和miR-203组,分别采用对照组和miR-203过表达慢病毒感染,筛选稳定细胞系。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和克隆形成实验分析两组细胞增殖能力;采用流式细胞术分析两组细胞凋亡和周期变化;采用Transwell实验分析两组细胞迁移能力;采用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-203靶基因;采用蛋白免疫印迹分析靶基因及相关蛋白表达水平。计量资料比较采用t检验。结果正常食管上皮HEEC细胞miR-203表达水平(1.19±0.17)明显高于食管癌TE-8、EC9706和EC-11细胞miR-203表达水平(0.56±0.11、0.39±0.09、0.47±0.10),差异有统计学意义(t=3.719、4.498、3.909,P<0.05)。对照组细胞miR-203表达水平(1.07±0.12)明显低于miR-203组细胞miR-203表达水平(3.41±0.19),差异有统计学意义(t=5.576,P<0.05)。对照组细胞吸光度(A)值(1.95±0.19)明显高于miR-203细胞A值(1.36±0.16),差异有统计学意义(t=3.274,P<0.05)。对照组细胞克隆形成率[(69.94±6.51)%]明显高于miR-203组细胞克隆形成率[(39.55±4.91)%],差异有统计学意义(t=5.901,P<0.05)。对照组细胞G0/G1期比例[(40.27±5.71)%]明显低于miR-203组细胞G0/G1期比例[(54.90±5.98)%],差异有统计学意义(t=3.821,P<0.05)。对照组细胞S期比例[(30.16±4.20)%]明显高于miR-203组细胞S期比例[(21.85±4.09)%],差异有统计学意义(t=3.019,P<0.05)。对照组细胞G2/M期比例[(28.86±3.57)%]明显高于miR-203组细胞G2/M期细胞比例[(24.66±4.01)%],差异有统计学意义(t=2.621,P<0.05)。对照组细胞迁移数量[(146.38±16.10)个]明显高于miR-203组细胞迁移数量[(85.32±10.57)个],差异有统计学意义(t=6.926,P<0.05)。RGS17是miR-203的靶基因。对照组细胞RGS17表达水平(3.09±0.31)明显高于miR-203组细胞RGS17表达水平(1.74±0.20),差异有统计学意义(t=5.194,P<0.05)。结论 miR-203通过靶向RGS17蛋白调控食管癌细胞增殖、凋亡、周期和迁移。

微小RNA-203对食管癌化疗敏感性的影响及其机制

目的探讨微小RNA(miR)-203对食管癌化疗敏感性的影响及其机制。方法采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析顺铂(DDP)耐药食管癌细胞株TE-8/DDP和亲本细胞株TE-8细胞中miR-203表达水平。将TE-8/DDP细胞株分为对照组和miR-203组,采用慢病毒感染建立对照和miR-203过表达细胞系。细胞计数试剂盒(CCK-8)分析对照组和miR-203组细胞对DDP的敏感性;流式细胞术分析两组细胞凋亡水平;生物信息学和双荧光素酶实验分析miR-203靶基因。蛋白质免疫印迹分析miR-203靶蛋白表达水平。计量资料比较采用t检验。结果亲本细胞株TE-8细胞miR-203表达水平(1.31±0.15)明显高于DDP耐药食管癌细胞株TE-8/DDP中miR-203表达水平(0.53±0.18),差异有统计学意义(t=4.801,P<0.05)。对照组细胞经50μg/ml和100μg/ml DDP处理36 h后细胞吸光度值(1.98±0.13、1.43±0.12)明显高于miR-203组细胞吸光度值(1.58±0.11、1.11±0.12),差异有统计学意义(t=3.781、3.017,P<0.05)。对照组细胞经50μg/ml和100μg/ml DDP处理36 h后细胞凋亡率[(30.54±5.81)%、(51.45±6.29)%]明显低于miR-203组细胞吸光度值[(49.29±5.00)%、(78.27±8.81)%],差异有统计学意义(t=3.781、3.017,P<0.05)。100 mg/kg DDP治疗20 d后,对照组细胞形成肿瘤体积[(498.35±43.10)mm3]明显大于miR-203组细胞体内肿瘤体积[(309.44±27.87)mm3],差异有统计学意义(t=5.091,P<0.05)。对照组细胞形成肿瘤质量[(8.91±1.29)g]明显高于miR-203组细胞体内肿瘤质量[(4.73±1.01)g],差异有统计学意义(t=3.182,P<0.05)。生物信息学和双荧光素酶结果显示三磷酸腺苷结合盒转运子E1(ABCE1)是miR-203的靶基因。对照组细胞ABCE1表达水平(0.89±0.09)明显高于miR-203组细胞ABCE1表达水平(0.25±0.07),差异有统计学意义(t=4.761,P<0.05)。对照组细胞半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3表达水平(0.38±0.09)明显高于miR-203组细胞Caspase-3表达水平(1.21±0.13),差异有统计学意义(t=6.281,P<0.05)。结论miR-203通过靶向ABCE1蛋白调控食管癌对顺铂的耐药性。

结肠癌相关转录因子1在非小细胞肺癌组织的表达及其对细胞增殖和迁移的影响

目的观察结肠癌相关转录因子1(CCAT1)在非小细胞肺癌中的表达及其对细胞增殖和迁移的影响。方法收集2017年8月至2019年8月河南省人民医院手术摘除的102例非小细胞肺癌组织和对应的癌旁组织作为研究对象。采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析非小细胞肺癌组织和癌旁组织中CCAT1表达水平。采用RNA干扰技术在A549细胞(购自中国科学院上海细胞库)建立CCAT1敲降稳定细胞株和对照细胞株,命名为CCAT1 KD组和对照组。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)测定两组细胞增殖;采用Transwell分析两组细胞迁移;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析细胞增殖和迁移相关蛋白的表达水平。组间比较采用t检验。结果与癌旁组织CCAT1水平(1.26±0.28)比较,非小细胞肺癌组织中CCAT1水平(3.47±0.31)显著增加,差异有统计学意义(t=3.091,P<0.05)。与对照组A549细胞CCAT1表达水平(1.09±0.15)比较,CCAT1 KD组细胞CCAT1表达水平(0.37±0.09)显著下调,差异有统计学意义(t=4.100,P<0.05)。与对照组细胞吸光度(A)值(1.84±0.26)比较,CCAT1 KD组细胞A值(0.98±0.14)显著下降,差异有统计学意义(t=3.719,P<0.05)。与对照组细胞EdU阳性率[(70.26±8.92)%]比较,CCAT1 KD组细胞EdU阳性率[(30.41±5.89)%]显著下降,差异有统计学意义(t=3.201,P<0.05)。与对照组细胞迁移数量[(128.44±9.17)个]比较,CCAT1 KD组细胞迁移数量[(59.19±8.01)个]显著下降,差异有统计学意义(t=3.172,P<0.05)。与对照组细胞细胞核增殖抗原(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)和黏着斑激酶(FAK)表达水平(1.18±0.16、1.21±0.20、1.08±0.19)比较,CCAT1 KD组细胞Ki-67、PCNA和FAK表达水平(0.25±0.14、0.38±0.09、0.31±0.13)显著下降,差异有统计学意义(t=3.207、3.801、3.510,P<0.05)。结论CCAT1在非小细胞肺癌组织中呈高表达,并参与非小细胞肺癌的增殖和迁移。