寡核苷酸片段载体的酶切连接和无缝克隆构建方法比较

目的比较酶切连接和无缝克隆方法在构建pCGS3-CK载体上的优缺点,为寡核苷酸片段载体的构建提供参考。方法酶切连接是需要合成两条互补的寡聚核苷酸单链,然后经过退火形成具有黏性末端的双链结构片段,在DNA连接酶的作用下与具有相同酶切的线性化载体连接,形成环状质粒。无缝克隆是在目标序列两端各加上15~20个与载体序列同源性的碱基,然后经过退火形成双链结构的目的片段,在重组酶的作用下与线性化的载体连接,形成环状质粒。结果从阳性率角度进行比较,酶切连接的阳性率为95.65%,而无缝克隆的阳性率为89.13%。结论与无缝克隆方法相比,用酶切连接方法构建寡核苷酸片段载体阳性率高,实验成本低。

抗CD47抗体Hu5F9真核表达载体构建与表达

目的在CHO-S细胞中表达抗白细胞分化抗原47(CD47)抗体Hu5F9,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将编码Hu5F9抗体轻、重链基因构建至真核表达载体,瞬转CHO-S细胞进行表达,取细胞上清检测后利用其人源Fc标签纯化抗体蛋白,并进行Western blot鉴定。结果经双酶切及基因测序验证Hu5F9载体构建成功,细胞上清经SDS-PAGE检测,可见抗体轻链、重链和完整抗体条带,抗体纯化后Western blot鉴定结果显示条带大小与预期一致。结论在CHO-S细胞中成功表达了抗CD47抗体Hu5F9,为后续的药物研发提供研究依据。

Fed-batch培养中补料及接种密度对RABV-G蛋白表达量的影响

目的研究流加(Fed-batch)培养中补料及接种密度对狂犬病毒糖蛋白G(RABV-G)蛋白表达量的影响,初步建立RABV-G蛋白在重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中Fed-batch培养的较优工艺方案。方法复苏培养1支能够稳定表达狂犬病毒RABV-G蛋白的重组CHO细胞,传代扩增后进行6种方案Fed-batch培养,从Fed-batch培养的第3天开始监测培养上清中目的蛋白表达量和细胞生长参数,第14天结束培养,分析比较不同策略所产生的目的蛋白表达量。结果本研究方案6中5%的Feed1补料及0.5×10~6cells/ml的起始接种密度在Fed-batch培养第14天,糖蛋白表达量达150 mg/L,显著高于其余5种方案,确立为优选方案。结论本研究建立了RABV-G蛋白在重组CHO细胞中流加(Fed-batch)培养的较优工艺方案,为重组狂犬病毒疫苗生产工艺研究提供基础。

带状疱疹疫苗研究进展

带状疱疹是一种常发生于老龄人群、免疫功能低下和慢性病人群皮肤上的一种簇集型水疱病,由潜伏在神经元内的水痘-带状疱疹病毒重新激活引发。带状疱疹的持续性疼痛使患者饱受痛苦,带来严重的精神负担和经济负担。在临床药物治疗效果不佳的情况下,国外先后有减毒活疫苗和伴佐剂的重组蛋白疫苗上市,根据这两款疫苗的临床数据分析,后者已经成为美国疾病控制和预防中心推荐的首选疫苗,国内多家企业也在开展这两种疫苗的临床研究。然而,由于佐剂来源的限制,重组蛋白疫苗尚未广泛提供。随着新型冠状病毒肺炎疫情的出现,mRNA疫苗的热度也被提升,国内生物制品企业应根据国内的市场需求并结合自身发展,积极开展新型带状疱疹疫苗的研制,填补国内疫苗的空缺,增强市场竞争力。本文就目前各个疫苗平台的带状疱疹疫苗研究进展和发展做简要综述。