综述式教学在硕士研究生分子生物学课程中的应用

从教学内容设计、教师及研究生授课形式以及结合研究生具体研究课题对硕士研究生分子生物学综述式教学进行了阐述.综述式教学不仅能够让研究生全面深入地掌握分子生物学基本理论知识,熟悉分子生物学研究思路和方法,了解分子生物学领域的新进展,并且能够达到通过专业课程教学培养研究生科研能力的目标.在研究生教学过程中应用综述式教学,能逐渐培养硕士研究生的科学研究兴趣,提高研究生科研创新能力和设计能力.

1株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

采集1例疑似感染猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)仔猪的粪便,运用RT-PCR方法和血清学方法对病料进行TGEV检测,并应用猪睾丸细胞(ST)进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和RT-PCR方法检测病毒在ST细胞中的增殖动态,应用RT-PCR方法扩增分离TGEV S1基因,经序列测定后,采用DNAStar 7.0和Mega 5.0软件对TGEV进行生物信息学分析。结果表明,病料接种到ST细胞培养后,出现明显细胞病变效应(CPE);RT-PCR检测结果显示,TGEV核酸阳性;血清学鉴定TGEV抗原阳性。将分离毒株命名为TGEV-NY。感染12 h后,IPMA检测结果阳性,且可从细胞培养上清中检出TGEV核酸。序列测定分析表明,分离毒株S1基因开放阅读框(ORF)为2 220 bp,编码740个氨基酸。进化分析显示,分离毒株与我国2006年分离的SC-Y毒株亲缘关系最近,分离毒株属于基因Ⅰ群。

1株犬细小病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

采集一疑似犬细小病毒(CPV)患犬的粪便,采用胶体金试纸条和PCR方法对病料进行CPV检测,并应用猫肾细胞F81进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和PCR检测病毒在F81细胞中的增殖动态,采用无血清培养和有血清培养2种方法进行体外培养,IPMA测定病毒滴度。利用PCR扩增分离病毒的VP2基因,经序列测定后采用DNAStar 7.0和MEGA 5.0软件进行生物信息学分析。结果表明,胶体金试纸条检测为CPV抗原阴性,PCR检测结果为CPV核酸阳性,病料接种到F81细胞培养后出现明显细胞病变(CPE),血清学鉴定为CPV抗原阳性,将分离得到的病毒命名为CPV-NY130615。IPMA可从感染后6 h的F81细胞中检出病毒,PCR能从感染后6 h培养上清中检出CPV核酸。血清同步接种培养法培养和无血清单层接种培养法培养的第15代病毒滴度分别为1×108.06TCID50/m L和1×107.65TCID50/m L。序列测定分析表明,该毒株VP2基因开放阅读框(ORF)为1 755 bp,编码584 aa。进化分析显示,该毒株属于CPV-2a型。

鸡胸腺肽β4、β15基因的原核表达及其生物学活性测定

为获得具有生物学活性的鸡胸腺肽β4、β15,根据大肠杆菌密码子偏爱性,设计合成鸡胸腺肽Tβ4、Tβ15基因片段,采用重叠PCR获得完整的Tβ4、Tβ15基因,将其连接到pET-28a(+)载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定,应用镍柱亲和层析纯化蛋白质,采用E玫瑰花环试验测定其生物学活性。结果显示,成功构建大肠杆菌表达载体pET28a-Tβ4和pET28a-Tβ15,目的蛋白在大肠杆菌中大量可溶性表达,蛋白质分子量大小均为6kD,镍柱亲和层析获得了纯化的蛋白质。E玫瑰花环试验结果显示,重组Tβ4的活力为35.5%,Tβ15的活力为18.7%,均能够明显增强T淋巴细胞的活性。表明Tβ4和Tβ15基因得到成功表达和纯化,并具有良好的生物学活性。

河南省毛翅目一新记录属种记述

毛翅目昆虫因其幼虫多喜栖息在清洁的水流中,被认为是水体水质监测的重要指示生物之一.本文报道了河南毛翅目昆虫的一新纪录属:Neucentropus Martynov,1907,并记录一新记录种:Neucentropus mandjuricus Martynov,1907.依据采集标本,对该属种上颚须、翅、雌、雄虫外生殖器等重要的外部形态特征进行了详细的补充记述,并提供了光镜照片.观察标本保存于南阳师范学院.

昆虫体细胞遗传性别决定信号通路的研究进展

昆虫遗传性别决定可分为体细胞性别决定、生殖细胞分化和剂量补偿效应3个层次。昆虫体细胞性别决定信号通路基本上都遵循从初始信号到关键基因,再到双性基因的信息流传递基本模式。不同昆虫间,体细胞性别决定初始信号(如X染色体剂量、M强雄基因、母系印迹及与PIWI相作用的RNA等)很复杂,关键基因(如sxl和tra/fem)有所变化,但双性基因(如dsx)很保守,且重要基因的剪接方式(如选择性剪接)非常保守。结合作者昆虫性别决定的研究工作,本文总结了双翅目、膜翅目和鳞翅目代表性昆虫种类的性别决定初始信号、关键基因及双性基因的研究进展及一般规律,为昆虫性别决定分子机制的进一步揭示、昆虫不育技术(SIT)的开发以及昆虫性别的人为操控提供理论基础。

3株传染性支气管炎病毒蛋鸡源河南株的S1基因序列分析

为了解河南省致蛋鸡产蛋量下降的传染性支气管炎病毒(IBV)的流行特征,从河南南阳、信阳和安阳等市的发病鸡场中鉴定出3株IBV,分别命名为CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018,并应用RT-PCR技术对3个IBV分离株的S1基因进行扩增与序列分析。结果显示,3个IBV分离株S1基因全长都为1617nt,编码539aa,并且都属于基因型4/91(CHⅡ);CK/CH/HN/NY1206/2017株S1基因裂解位点为RRSRR,CK/CH/HN/XY911/2017株S1基因裂解位点为RRSRR,CK/CH/HN/AY119/2018株S1基因裂解位点为RRFRR;3个分离株间核苷酸序列及其推导的氨基酸序列具有较高同源性,与位于同一基因型的参考毒株间同源性较高,与我国使用的Mass型常规疫苗H120和H52株的核苷酸和氨基酸同源性最低,分别仅为78.3%~78.4%和74.8%~75.4%,与4/91(CHⅡ)型疫苗4/91株的核苷酸和氨基酸同源性较高,分别达到94.7%~99.3%和93.9%~98.1%。综上,河南省致蛋鸡产蛋量下降的IBV流行株基因型相对统一,使用4/91(CHⅡ)型疫苗应可提高蛋鸡抗IBV的效率。

农业害虫生物防治的现状及发展趋势综述

针对目前农业害虫的生物防治方法,分别介绍了生物天敌、生物农药、昆虫信息素、昆虫生长调节剂在农业害虫防治中的研究现状,阐述了各种生物防治方法的应用优势,并分析了农业害虫生物防治中存在的问题及其发展趋势。

植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母三种微生物对黑腹果蝇行为和发育的影响

【目的】肠道微生物在宿主的多种生命活动中发挥重要作用。本研究旨在通过研究植物乳杆菌Lactobacillus plantarum,苹果醋酸杆菌Acetobacter malorum和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 3种微生物对黑腹果蝇Drosophila melanogaster觅食、产卵和发育的影响,进一步阐明肠道微生物与宿主的互作调控机制。【方法】采用引诱实验检测体外培养的植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母对交配前后黑腹果蝇成虫的引诱力以及这3种微生物的单一微生物和其中2种或3种微生物的混合物对非处女蝇的引诱力。采用产卵选择实验检测黑腹果蝇非处女蝇对单一微生物和其中2种或3种微生物的混合物的产卵偏好。将黑腹果蝇卵在接种分别含有植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母的培养基和正常培养基(对照)上培养,测量幼虫体重;同时将卵在分别含有活菌或灭活的这3种单一微生物的培养基上和正常培养基上培养,统计化蛹数,以检测不同微生物对黑腹果蝇幼虫发育的影响。将黑腹果蝇幼虫在分别含有植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母的培养基及正常培养基中培养72 h,qRT-PCR检测胰岛素信号通路的关键基因InR在黑腹果蝇幼虫中的相对表达量变化。【结果】苹果醋酸杆菌主要影响黑腹果蝇的产卵,酿酒酵母和植物乳杆菌则可同时影响黑腹果蝇觅食和产卵,且与单一微生物相比,非处女黑腹果蝇更趋向于含有2种或3种微生物的混合物。产卵选择实验表明,3种单一供试微生物及其中2种或3种微生物的混合物对黑腹果蝇的产卵选择具有显著的吸引力,其中混合物的影响最大,然后依次是苹果醋酸杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌。3种微生物均可促进黑腹果蝇幼虫的发育,活菌在接种早期加快幼虫到蛹的发育,灭活菌的促进作用则相对滞后。与对照比较,InR在接种苹果醋酸杆菌的培养基上培养的黑腹果蝇幼虫中的表达量显著降低,而在分别接种植物乳杆菌和酿酒酵母的培养基上培养的幼虫中则被显著促进表达。【结论】苹果醋酸杆菌可引诱黑腹果蝇的产卵,酿酒酵母和植物乳杆菌对黑腹果蝇的觅食和产卵都有具有引诱力;同时微生物的多样性可增加黑腹果蝇的觅食和产卵偏好。植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母可能通过不同的调控机制影响黑腹果蝇幼虫的生长发育。

不同肠道微生物对果蝇交配行为的影响

通过构建黑腹果蝇的无菌和悉生体系,比较研究不同肠道微生物对无菌果蝇和正常果蝇交配行为的影响。对黑腹果蝇受精卵进行体外消毒处理并在无菌条件下培养获得无菌果蝇。在果蝇培养基中分别接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、醋酸杆菌(Acetobacterium malorum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),然后对无菌果蝇或正常果蝇分别培养一定时间,获得不同微生物的悉生果蝇。解剖并提取果蝇肠道总RNA,反转录后利用实时荧光定量PCR检测不同微生物在接种前后无菌果蝇和正常果蝇肠道中的丰度,同时对不同处理的果蝇进行单对交配实验,比较不同处理果蝇的交配成功率和交配时间。结果表明:成功构建了无菌果蝇体系,通过与单一微生物共培养,使特定微生物在无菌果蝇和正常果蝇肠道中成功富集,而且植物乳杆菌L.plantarum可通过延长交配潜伏期影响果蝇的交配行为。

南阳地区食蚜蝇科昆虫名录及区系分析

食蚜蝇科(Syrphidae)隶属于双翅目,具有较大的经济价值,同时对生态多样性监测有重要作用.通过整理有关文献资料,整理出河南省南阳地区食蚜蝇科昆虫的物种名录及其分布信息,并分析其区系构成和分布特点.结果表明,该地区共分布食蚜蝇107种,隶属于3亚科15族45属.在世界动物地理区划中,共11个区系型,以古北界-东洋界种类最多.在中国动物地理区划分中,发现该地区食蚜蝇物种共有30式区系型,无单区分布型,其中全区分布和华北区-华中区两个区系型所占比重最大.区系分析结果体现了南阳地区食蚜蝇分布符合东洋界、古北界成分南北过渡的动物地理特征.本研究初步掌握了南阳地区食蚜蝇科昆虫的基本组成和区系分布特点,为该地区生物多样性保护及生态可持续发展提供了基础资料.

过量表达甲酸脱氢酶提高大肠杆菌合成L-2-氨基丁酸的效率

为了实现L-2-氨基丁酸(L-ABA)的高效生物合成,借助pACYCDuet-1和pET28a共表达系统,构建了携带L-苏氨酸脱氨酶(L-TD)、L-亮氨酸脱氢酶(L-L-DH)和不同活性甲酸脱氢酶(FDH)编码基因的重组大肠杆菌,分别命名为:E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-Ec TD-Es LeuDH:pET28a-Cb FDH和E.coli BL21(DE3)/p ACYCDuet-1-Ec TD-Es Leu DH:p ET28a-Cb FDH^(M)。经诱导表达后,L-苏氨酸脱氨酶和L-亮氨酸脱氢酶在两个重组大肠杆菌中的表达水平基本一致,而后者的甲酸脱氢酶酶活表达水平为(342.00±9.40)IU/mL,显著高于前者的(196.00±6.20)IU/mL。在50 mL反应体系中,200 mmol/L L-苏氨酸经220 r/min、30℃下反应6 h时,前者L-ABA得率为71%,后者为85%。结果表明,提高甲酸脱氢酶的表达水平可以显著提高L-ABA的合成效率。此外,优化反应温度后,在35℃下反应6 h时,L-ABA的得率可达90%。

植物乳杆菌植酸酶理性设计及表达鉴定

植酸酶能将植酸水解成肌醇衍生物,并释放出无机磷酸,是一种重要的生物催化剂。植酸酶的热稳定性和比活性是决定其潜在应用价值的2个关键因素。该研究从植物乳杆菌中克隆到了具有233个氨基酸残基、高活性的植酸酶基因(LpPHY233),并在大肠杆菌中实现了高水平的异源表达,其表达水平是植物乳杆菌的800倍。基于理性设计的结果,通过二硫键工程显著提高了Lp PHY233的温度特性和催化性能。突变体Lp PHY233S58C/K61C的最适反应温度较Lp PHY233提高了15℃。此外,它还具有良好的pH特性和动力学参数,在食品加工和饲料添加剂领域具有较大的应用前景。该研究结果为植酸酶的进一步分子修饰和工业应用提供了坚实的理论基础。

旱胁迫相关绿豆VrERF家族基因发掘及表达分析

【目的】探究AP2/ERF转录因子在绿豆干旱胁迫响应中的应答机制。【方法】基于全基因组测序数据对绿豆VrERF家族基因的种间同源性、互作蛋白功能及顺式作用元件进行分析,通过转录组测序数据分析各VrERF基因的组织特异性表达、干旱胁迫下基因表达差异情况并用q RT-PCR进行验证。【结果】绿豆与豌豆、菜豆和大豆的ERF家族基因间不仅具有相同的进化起源,还存在明显的基因扩张现象。VrERF基因启动子区均具有多个与激素响应、胁迫响应以及生长发育相关的顺式作用元件。此外,不同的绿豆VrERF蛋白间存在广泛的互作关系,可能通过与b ZIP、RAP2.4和STZ等蛋白互作参与绿豆非生物胁迫的防御响应。基因表达分析显示,多数VrERF家族基因的表达具有较强的组织特异性,且在干旱胁迫下,VrERF7/62在绿豆VC1973A和JP226873叶片中均显著下调表达,qRTPCR检测也显示VrERF7/62的表达受干旱胁迫诱导显著下调。【结论】推测VrERF7/62可能在绿豆干旱胁迫响应过程中起负调控作用,结果也为绿豆AP2/ERF家族基因的抗逆性表达及基因功能研究奠定了基础。

玉米AGO基因的克隆与表达分析

以玉米自交系‘昌7-2’三叶期前后2个时间点(种子萌发后5d和8d)幼苗不同组织部位的总RNA为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对玉米中6个Argonaute(AGO)蛋白家族基因(AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO7和AGO10)在幼苗不同发育时期及不同组织部位的表达谱进行了研究。结果表明:(1)AGO1、AGO2、AGO4和AGO7在种子萌发后5d和8d幼苗不同组织中均有表达,种子萌发后5d幼苗中的平均表达量均高于萌发8d的幼苗,且在地上部分新生组织或细胞分裂比较旺盛的组织中表达较多,表明AGO1、AGO2、AGO4和AGO7可能在玉米幼苗发育早期的分生组织分裂生长中发挥调控作用。(2)AGO5和AGO10只在叶片和茎尖中表达,其他组织中不表达;其中AGO5主要集中在新生叶和种子萌发后8d的茎尖中,AGO10在玉米叶发育过程中可能存在着迁移的现象。

杆状病毒多基因表达系统介导的轮状病毒样颗粒表达与组装

目的构建能同时表达轮状病毒vp2、vp6、vp7基因的重组家蚕杆状病毒,并在BmN细胞中进行初步表达。方法利用MA104细胞繁殖人A组轮状病毒,RT-PCR扩增病毒结构蛋白vp2、vp6、vp7基因,连接至转移载体pFBDM和pUCDM中,同时引入含IE1启动子的绿色荧光蛋白基因利于检测感染和表达量,再分别通过Tn7及Cre-LoxP重组构建重组病毒。为方便检测基因的表达,在VP7的C-末端添加6-组氨酸(6-His)标签,可通过ELISA等方法快速检测目的基因表达。结果扩增获得了轮状病毒三个结构蛋白基因,构建了能高效组装轮状病毒样颗粒的重组表达载体,ELISA检测VP7得到了表达,在BmN细胞中观察到病毒样颗粒。结论成功构建杆状病毒多基因的表达系统,为生产多亚基蛋白复合物,研究大分子结构提供借鉴。

家蚕化学感受蛋白CSP16的表达及结合特性分析

【目的】化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在昆虫化学信号的感受识别和生长发育调节等生理过程具有重要作用。本研究旨在探索CSP16在家蚕Bombyx mori中的功能。【方法】利用RT-q PCR分析csp16在家蚕不同发育时期和不同组织的表达特征,用原核表达系统对家蚕CSP16进行表达纯化,并通过荧光结合实验检测该蛋白与不同配体化合物的结合特性。【结果】RT-q PCR结果表明,csp16在家蚕1-5龄幼虫中呈规律性表达,各龄期眠蚕中表达量最高,5龄第3天幼虫中主要表达于头、表皮、精巢和卵巢等。蜕皮激素(20E)处理后csp16在不同龄期幼虫和5龄幼虫不同组织中的表达量上调。纯化后CSP16的荧光结合实验表明,CSP16与醇类、酯类、醛类、酚类和苯环类等化合物的亲和力都较弱。【结论】csp16在家蚕不同龄期幼虫眠蚕中表达量最高,蜕皮激素使csp16在家蚕取食幼虫中的表达量出现上调,提示其可能参与家蚕幼虫的蜕皮过程。

犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

试验旨在制备犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白多克隆抗体。构建pET28a-CPV-VP2重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化目的蛋白与佐剂混合、乳化制备后作为免疫原,免疫家兔制备VP2蛋白多克隆抗体;采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)检测抗体的免疫活性、抗体滴度、病毒滴度及中和活性。结果表明,重组VP2蛋白(rVP2)以包涵体形式存在,分子质量约为72ku;所制备的多克隆抗体滴度为1 600倍,病毒滴度为107 TCID50/mL,中和效价为1∶2 884,该抗体与体外培养的CPV呈特异性反应,CPV VP2蛋白的多克隆抗体免疫活性和特异性良好,且中和活性高,为CPV基因工程疫苗的研究和临床治疗奠定了基础。

鸡Mx蛋白抗病毒作用研究进展

Mx蛋白是在脊椎动物机体细胞受病毒感染或诱生剂处理时由Ⅰ型干扰素诱导表达的一种抗病毒蛋白。Mx蛋白具有良好的抗病毒能力,靶向许多RNA病毒,诸如流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒等,对某些DNA病毒,例如乙型肝炎病毒也有一定的作用。近年来,基于鸡的Mx蛋白抗病毒作用及机制的相关研究逐渐增多,取得了一些进展。论文就近年来鸡Mx蛋白的抗病毒机制与分子生物学特点进行综述,针对鸡Mx蛋白在抗病毒与品种鸡抗病育种筛选等应用前景进行分析与探讨。

猪Cdk2基因的克隆及其功能研究

本研究旨在克隆猪Cdk2基因,并研究其编码蛋白CDK2的生物学功能。采用RT-PCR扩增猪Cdk2基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸特征,并预测编码蛋白的生物学功能;利用半定量RT-PCR方法分析该基因在猪各个脏器和组织中的表达情况;共聚焦显微镜观察CDK2的亚细胞定位,采用过表达和shRNA干扰技术研究CDK2在细胞周期和细胞增殖中的调控作用。结果表明,猪Cdk2基因开放阅读框(ORF)为897bp(GenBank:JX967576),该基因与绵羊、牛、山羊、人、金仓鼠、小鼠、仓鼠和沟鼠Cdk2的核苷酸相似性依次为94.2%、94.0%、93.8%、93.4%、91.8%、91.0%、90.6%和89.9%,与牛、山羊和绵羊的亲缘关系最近;Cdk2编码298aa,CDK2分子质量为34ku。Cdk2mRNA在猪10个不同脏器和组织中均有表达。CDK2定位于细胞质和细胞核中,并通过蛋白酶体途径降解。猪CDK2在PK-15细胞中过表达引起S期细胞比例显著减少及G2/M期细胞比例显著增加(P<0.05),而G0/G1期无显著变化;相反,CDK2表达量降低引起S期细胞比例显著减少及G0/G1期细胞比例显著增加,而G2/M期无显著变化。本研究成功克隆了猪Cdk2基因并对其编码蛋白生物学功能进行了初步研究。