免疫学技术在霉菌毒素检测中的应用

中国是饲料生产第一大国,饲料质量安全关系到养殖业发展的兴衰。霉菌毒素污染严重危害饲料及饲料原料质量安全,因此,建立毒素检测方法对预防霉菌毒素污染,减少毒素中毒事件发生至关重要。综述了霉菌毒素的性质、危害及免疫学检测方法的发展,并展望了毒素检测方法的发展趋势。

PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及条件优化

从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)河南分离株(HN07-1、HN07-2)的细胞培养物中提取RNA,根据参考株IAF-exp91 N蛋白基因序列设计出2对引物,成功克隆出ORF7全长基因,并连接至pMD-19T载体。基因测序结果表明,2株PRRSV河南分离株ORF7基因序列完全相同;该序列与HB-4(hs)同源性为100%,与标准美洲株VR-2332和我国早期分离的BJ-4株同源性为93.8%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达条件进行优化。SDS-PAGE和Western-blot结果表明,成功表达了约40 kD的融合蛋白;使用1.0 mmol/L的IPTG在2×YT培养基中诱导8 h可获得最大表达量。

碳二亚胺法制备阿莫西林人工抗原及其鉴定

合成、鉴定了阿莫西林(amoxicillin,AMO)人工抗原,并通过动物免疫法生产了亲和力高、特异性好的鼠源AMO多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将AMO分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成完全免疫抗原AMO-BSA和检测抗原AMO-OVA,经紫外分光光度法和SDS-PAGE以及动物免疫进行鉴定。结果表明,偶联后的紫外吸收峰与BSA和AMO相比都发生了一定的位移,AMO-BSA在276nm处出现最大吸收峰,BSA的泳动速度大于AMO-BSA。免疫后获得的3只小鼠多抗血清,通过间接竞争ELISA测定,效价可达1×10-4以上,1号小鼠半数抑制浓度(IC50)为573.75ng/mL,敏感性较好。AMO完全人工抗原的合成以及鼠源多克隆抗体血清的制备,为AMO单克隆抗体的制备奠定了基础。

伏马菌素B_1人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

本研究合成并鉴定伏马菌素B1(FB1)人工抗原,通过动物免疫制备敏感性高、特异性好的鼠源FB1多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将FB1分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成免疫抗原FB1-BSA和检测抗原FB1-OVA,经鉴定后,分别按10和30μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔3周,最后1次免疫30d后,断尾采血,制备多抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。结果表明,免疫的6只小鼠效价均达1∶104以上,3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为61.3ng/ml,且具有良好的特异性。本试验成功合成了FB1人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的鼠源多克隆抗体血清,为FB1单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星(FLE)人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法(UV Scan)和聚丙烯凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6—7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng·mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件:包被浓度:5μg·mL-1;抗体工作浓度:1﹕6400;二抗稀释度:1﹕1000;底物显色时间:10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng·mL-1,标准曲线回归方程为y=-0.3627x+1.3517(R2=0.9956),与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%—87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%—10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%—88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%—10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng·mL-15个标准浓度B/B0的批内变异系数在3.39%—6.68%,批间变异系数在4.69%—9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%—110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物(CTN-OH);采用N,N-羰基二咪唑法(CDI)将CTN-OH与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng.mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng.mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

T2毒素人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定T 2毒素人工抗原,通过动物免疫制备敏感性高、特异性好的鼠源T 2毒素多克隆抗血清。采用琥珀酸酐法将T 2毒素活化为T 2HS,T 2HS在碳二亚胺(EDC)作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联,合成免疫抗原T 2 BSA和检测抗原T 2OVA,经鉴定后,分别按30、50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后1次免疫10d后,断尾采血,制备多抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定其敏感性和特异性。结果表明,免疫的6只小鼠效价均达到了1∶104以上,2号小鼠多抗血清的敏感性最好,其半数抑制质量浓度(IC50)为324ng/mL,且具有良好的特异性。成功合成了T 2毒素人工抗原,制备了多克隆抗体血清,为T 2毒素单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

纳米颗粒疫苗研究进展

纳米颗粒指小于100-1000nm的微粒，纳米颗粒疫苗不但能提高抗原的稳定性和免疫原性，而且能够靶向性递呈抗原和缓慢释放，增强机体产生免疫应答。综述了近年来纳米颗粒在疫苗发展过程中的应用，介绍了不同纳米颗粒作为运输系统或免疫佐剂与免疫细胞之间的相互作用。

猪瘟病毒E^(rns)/E2融合蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及评价

为了建立猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,将CSFV E^(rns)和E2蛋白主要抗原区串联表达的编码核酸序列克隆至原核表达载体pET-32a中,转化大肠杆菌Rosetta TM2(DE3)构建重组表达菌。SDS-PAGE、Western blot鉴定及蛋白质可溶性分析结果显示,表达的E^(rns)/E2蛋白分子质量约为43 ku,能够被CSFV阳性血清识别,主要以包涵体形式存在。通过快速稀释法复性了纯化的包涵体蛋白,复性效率大于40%。以纯化复性的E^(rns)/E2蛋白为包被抗原,经优化各反应条件,建立了间接ELISA检测CSFV抗体方法(E^(rns)/E2-ELISA)。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用建立的E^(rns)/E2-ELISA检测方法对121份随机采取的临床血清样本进行检测,与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比,E^(rns)/E2-ELISA检测方法符合率为86.78%,敏感性为92.11%,特异性为77.78%。利用建立的E^(rns)/E2-ELISA检测方法和IDEXX CSFV抗体检测试剂盒同时评价CSFV C株疫苗免疫的4只30日龄健康仔猪抗体消长规律,可分别于免疫后7 d和14 d开始检出阳性,35~42 d抗体水平达到高峰,49~56 d抗体趋于稳定。

草甘膦人工抗原合成及鼠源多抗血清制备

为检测小分子农药草甘膦(PMG)的残留,本研究合成草甘膦[N-(Phosphonomethyl)glycine PMG]人工抗原,通过免疫制备高敏感性、特异性的鼠源PMG多克隆抗血清;采用EDC法将PMG分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成免疫原PMG-BSA和包被原PMG-OVA;经紫外扫描、SDS-PAGE电泳、质谱鉴定后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清;利用间接ELISA法测定多抗血清效价,竞争ELISA测定多抗血清的敏感性和特异性。结果表明,所合成的免疫抗原效果较好,免疫的4只小鼠效价均达1∶104以上,4号小鼠的多抗血清敏感性最高,半数抑制浓度IC50为31.4μg·m L-1,与其他有机磷类农药无交叉反应,具备良好的特异性。本试验成功合成了PMG人工抗原,并制得了敏感性高、特异性好的鼠源多抗血清,为PMG单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

噬菌体展示技术在毒素检测分析中的应用

霉菌毒素严重危害动物及人类健康,毒素检测已成为评价农产品、食品、饲料品质的重要内容之一。毒素检测有一定危险性,建立新的毒素检测手段意义重大。噬菌体展示技术是一种设计精巧、具有极强分离多肽功能的生物学技术。综述了此项技术的发展和在筛选霉菌毒素模拟表位肽中的作用及模拟表位肽在毒素检测中的应用,并展望了该技术的应用前景。

鸡LTBP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了研究鸡潜在转化生长因子结合蛋白(LTBP1)功能,构建原核表达重组质粒pET-30a-LTBP1,转化E.coli BL21感受态细胞并经IPTG诱导进行表达。对以包涵体形式表达的LTBP1蛋白进行变复性和亲和层析纯化,然后免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术建立单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备抗鸡LTBP1的单克隆抗体。通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选,获得了2株杂交瘤细胞株3C11-A9和2B1-G7。以效价较高的3C11-A9制备单克隆抗体腹水,间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验结果均表明,单克隆抗体3C11-A9可特异性识别鸡源细胞CEF和DF-1表达的LTBP1蛋白,同时IFA结果还显示,3C11-A9单克隆抗体腹水可与包括人、猴、猪和鼠在内的8种常见哺乳动物细胞发生特异性染色。综上,成功制备了抗鸡LTBP1单克隆抗体,且具有多物种广谱识别特性。

8株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

本研究拟初步了解中原地区近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况。对2011—2012年间从河南及周边省份发病猪场分离的8株PRRSV毒株Nsp2基因变异区进行RT-PCR扩增,同时对主要结构蛋白GP5基因进行克隆测序并与GenBank中登录的中国历年来流行的PRRSV代表毒株的GP5蛋白序列进行遗传进化分析,对主要氨基酸基序进行比对分析。结果表明,2011—2012年在中原地区分离的8株PRRSV分离株均为Nsp2缺失变异株,GP5基因与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同源性较高。

2009-2011年市售商品化猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的质量评估

为了解目前市售商品化猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的质量,利用TCID50效价测定和RT-PCR 2种方法对2009-2011年市场销售的主要国产疫苗产品进行了检测。结果发现,目前市售的疫苗产品中活病毒含量差异较大,虽然部分产品可达103.80 TCID50/头份,但有些产品含量极低。RT-PCR检测结果与TCID50效价测定的结果基本一致。这表明目前市售的乙脑疫苗质量良莠不齐,部分疫苗的抗原含量可能难以满足生产要求,这为规模化猪场乙脑防控的疫苗选择提供了重要参考依据。

利用噬菌体随机肽库筛选抗原模拟表位的研究进展

噬菌体随机肽库技术是将编码外源多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白结构基因的表达而表达,被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性,是一种基因型与表达型的统一。近年来,噬菌体随机肽库技术被广泛应用于各种抗原的模拟表位筛选中,并取得了显著成果。综述了利用噬菌体随机肽库技术在抗原模拟表位筛选中的研究进展。

猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定

为获得含合成肽疫苗抗原多肽的重组表达蛋白,根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,并克隆至表达载体pET32a中,构建原核表达质粒pET32a-P2。将重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,在分子量27 kD处有1条明显的蛋白表达条带,且能被O型FMDV阳性血清识别。对表达产物进行可溶性分析,结果显示,表达蛋白几乎全部以可溶形式存在。表达蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白在27 kD处有单一目的条带,具有较高的纯度。ELISA检测结果显示,纯化的重组蛋白具有较高的活性。结果表明,该抗原多肽的双拷贝串联重复序列在大肠杆菌中得到了可溶性高效表达,为开发诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。

食品中“新型瘦肉精”的检测方法研究进展

对苯乙醇胺A、赛庚啶、可乐定、巴氯芬等常见"新型瘦肉精"药物的检测方法进行综述,主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、毛细管电泳法等仪器检测方法以及酶联免疫法、免疫层析法、电化学发光免疫法等免疫分析方法,为保障我国动物性食品安全提供更好的技术支撑。

水貂阿留申病毒串联表位重组抗原的表达及血清学初步评价

为探究水貂阿留申病毒(ADV)VP2主要抗原表位在水貂阿留申病血清学诊断中的作用,本试验将VP2蛋白主要抗原区的表位基因用柔性肽串联连接,将其克隆到表达载体pET-30a(+)中进行原核表达,并对诱导条件进行优化。利用Ni-NTA His-Bind纯化系统对融合蛋白进行纯化,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,并将融合蛋白作为检测抗原进行CIEP试验。结果显示,融合蛋白在IPTG终浓度为1mmol/L、37℃诱导表达4h,蛋白表达量最高,其大小约为30000,以可溶性表达形式为主;融合蛋白能与6×His单克隆抗体及ADV多克隆抗体发生特异性反应,说明该蛋白具有较好的反应原性;且该蛋白作为对流免疫电泳技术(CIEP)检测抗原与ADV阳性血清之间产生了明显的沉淀线,证实了该蛋白作为CIEP检测抗原的可能性。以纯化后的重组蛋白为抗原初步建立的间接ELISA方法具有较高的准确性。结果表明该蛋白具有良好的血清学检测价值,为水貂阿留申病血清学诊断方法的建立奠定了基础。

猪乙脑病毒分离株CSF.XZ2D在BHK21细胞上的传代培养及E基因序列分析

为了解河南省规模化猪场日本乙型脑炎病毒(JEV)流行株的特征及其遗传基因的稳定性,将猪乙脑病毒分离株CSF.XZ-2D在BHK-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代25次后病毒E基因趋于稳定,氨基酸位点E271(E→V)和E278(V→L)传代后发生稳定点突变。与JEV毒力相关的部分位点如E107、E138、E176、E177和E315遗传稳定性较高,经连续传代后均未发生突变,与SA14-14-2相应位点完全一致。但是,另外一些位点的遗传稳定性较差,如E279和E312分别出现K→M→K和K→R→K→R的反复突变。这些突变是否与JEV的宿主细胞适应性及毒力变化相关有待进一步研究。

针对牛病毒性腹泻病毒RNA干扰真核表达载体的构建与鉴定

牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）会引起牛病毒性腹泻一黏膜病（bovineviraldiarrheamucosaldisease，BVD—MD），造成牛腹泻、发热、黏膜恶性坏死，甚至可以在孕牛体内通过胎盘传染给幼牛，使得产下的幼牛终身带毒，成为持续感染源。牛病毒性腹泻在世界各地都普遍存在，P．Olafson等在1946年首次对此病进行了报道，近些年来，其发生、流行呈上升趋势，在养牛业发达的地区则更为严重，给全球畜牧业造成极大危害和重大的经济损失。