O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析

为了高效可溶性表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1结构蛋白,根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化合成VP0和VP1基因片段,并将其克隆到p E-SUMO载体中,构建重组质粒SUMOVP0和SUMO-VP1,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,并优化诱导温度、时间和IPTG浓度等表达条件。结果显示,SUMO-VP0可溶性蛋白表达的最佳条件为:20℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h;SUMO-VP1可溶性蛋白表达的最佳条件为:37℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明,表达的SUMOVP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,具有很好的反应原性。

马立克氏病病毒编码的miR-M12-5p对鸡HVCN1基因表达的靶向调控

为研究miR-M12-5p在马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染过程中的调控作用,利用生物信息学方法对其候选靶基因进行预测分析,发现4个miR-M12-5p的结合靶点。体外双荧光素酶报告试验结果表明,miR-M12-5p可结合宿主鸡的氢离子电压门控通道1(HVCN1)基因mRNA的3'-UTR相应位点并发生特异性相互作用。实时荧光定量PCR分析进一步证实,miR-M12-5p能够在体内下调HVCN1基因的表达水平。上述结果表明,miR-M12-5p可以靶向调控宿主基因HVCN1的表达。

猪细小病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备具有中和活性的抗猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)单克隆抗体,采用血凝试验(HA)鉴定纯化的重组PPV VP2蛋白的活性,将重组VP2蛋白与弗氏佐剂混合后免疫BALB/c小鼠。免疫3次后,小鼠血清的血凝抑制(HI)效价可达1∶2^(16),取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞,采用有限稀释法进行多轮亚克隆,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选,成功获得杂交瘤细胞株5F7和11B3,能够稳定分泌中和性单克隆抗体。单克隆抗体5F7和11B3的轻链型均为Kappa,重链型分别为IgG2a和IgG2b。经ELISA和IPMA检测,单克隆抗体5F7和11B3均能与重组PPV VP2蛋白和PPV病毒粒子发生特异反应,而与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。5F7和11B3腹水针对PPV病毒反应的ELSIA效价分别为1∶10 240和1∶20 480;针对PPV感染PK15细胞的中和效价分别为1∶2^(11)和1∶2^(10)。Western blot鉴定结果显示,单克隆抗体5F7和11B3均不与变性的VP2蛋白发生反应,说明2株单克隆抗体均识别重组PPV VP2蛋白的构象型表位。综上,成功制备了2株具有中和活性的抗PPV单克隆抗体。

乙脑病毒猪源分离株CSF.XZ-2D感染BHK-21细胞毒的浓缩及纯化

研究了日本流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）猪源分离株CSF.XZ-2D感染的BHK-21细胞培养物中JEV的浓缩及纯化方法,对浓缩及纯化后的病毒TCID_（50）效价分别进行测定。结果表明,经差速离心后病毒液在4℃条件下分别以30 000 r/min、40 000 r/min、50 000r/min、60 000 r/min超速离心3 h,其中50 000 r/min超速离心可将绝大部分JEV病毒粒子充分沉淀至离心管底部,浓缩效果最佳;病毒沉淀用PBS重悬后进行不连续蔗糖密度梯度离心,病毒粒子主要集中在35%~50%的区带蔗糖层。

猪圆环病毒2型的分离鉴定及其全基因组序列分析

为分离鉴定流行于河南省的猪圆环病毒2型(PCV2),对河南省不同地区猪场的11份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪的病料进行分离鉴定,得到PCV2毒株。通过PCR检测,11份临床疑似病料中,7份确诊为PCV2阳性病料,阳性率为63.6%。挑选出阳性值较高的毒株命名为zmd-20161022,通过增殖培养筛选出优良毒株,并对其进行单层过氧化物酶试验(IPMA)鉴定,分析免疫原性;应用PCR对该病毒全基因组进行特异性扩增,经测序后对该病毒的同源性和系统进化进行分析。结果显示,该毒株序列全长1 767 bp,同源性分析发现与国内3株PCV2毒株(AY686763、HM641752、HM038034)的同源性为95.2%~98.3%,与基因登录号为HM038030.1的同源性高达98.6%。系统进化树分析发现,zmd-20161022毒株与基因登录号为HM038030.1的亲缘关系很近,被鉴定为PCV2b-1c型,属于PCV2b的一种亚型。

水貂阿留申病毒串联表位重组抗原的表达及血清学初步评价

为探究水貂阿留申病毒(ADV)VP2主要抗原表位在水貂阿留申病血清学诊断中的作用,本试验将VP2蛋白主要抗原区的表位基因用柔性肽串联连接,将其克隆到表达载体pET-30a(+)中进行原核表达,并对诱导条件进行优化。利用Ni-NTA His-Bind纯化系统对融合蛋白进行纯化,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,并将融合蛋白作为检测抗原进行CIEP试验。结果显示,融合蛋白在IPTG终浓度为1mmol/L、37℃诱导表达4h,蛋白表达量最高,其大小约为30000,以可溶性表达形式为主;融合蛋白能与6×His单克隆抗体及ADV多克隆抗体发生特异性反应,说明该蛋白具有较好的反应原性;且该蛋白作为对流免疫电泳技术(CIEP)检测抗原与ADV阳性血清之间产生了明显的沉淀线,证实了该蛋白作为CIEP检测抗原的可能性。以纯化后的重组蛋白为抗原初步建立的间接ELISA方法具有较高的准确性。结果表明该蛋白具有良好的血清学检测价值,为水貂阿留申病血清学诊断方法的建立奠定了基础。