葡萄VlCKX4表达特性分析与转录调控预测

【目的】通过克隆细胞分裂素脱氢酶/氧化酶基因VlCKX4及其启动子,进行表达特性分析和启动子活性分析并进行转录因子预测,为深入解析VlCKX4介导细胞分裂素信号途径调控葡萄坐果的分子机制提供依据。【方法】使用生物信息学方法分析‘巨峰’葡萄(Vitis vinifera×Vitis labrusca)细胞分裂素氧化酶/脱氢酶4(VlCKX4)的序列特征;利用PCR技术克隆该基因以及它的启动子,使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)分析VlCKX4的表达特性,GUS活性试验用于分析其启动子活性;利用PlantTFDB、CisBP等转录调控数据库对VlCKX4的转录调控关系进行预测分析,输出结果使用Gephi软件进行可视化。【结果】VlCKX4全长1 582 bp,其中包含1 566 bp的开放阅读框,编码522个氨基酸,具有家族特征的FAD结构域和细胞分裂素结合(ck-binding)结构域。qRT-PCR结果表明VlCKX4在花序中高表达,其次是叶片,在卷须中表达量最低;细胞分裂素CPPU处理后VlCKX4表达量先下降后上升,细胞分裂素抑制剂洛伐他汀(Lov)处理后VlCKX4表达量先上升后下降。顺式元件分析表明VlCKX4启动子中含有吲哚乙酸、茉莉酸甲酯等响应元件;GUS化学组织染色试验表明,VlCKX4响应这些激素的处理。VlCKX4转录调控预测分析结果显示,MYB、DOF和WRKY类转录因子对其进行转录调控,结合转录组数据和共表达关系确定WRKY20、DOF1.5和MYB59为关键候选转录因子。【结论】葡萄VlCKX4受到细胞分裂素CPPU的诱导,VlCKX4启动子受到WRKY20、DOF1.5和MYB59转录因子的调控,参与促进葡萄坐果过程。

葡萄芽变机制研究进展及应用

芽变作为一种重要的果树育种手段,受到研究者和育种家的高度重视。环境条件等因素是诱导体细胞突变形成芽变的主要原因,L1、L2不同细胞层的变异引起葡萄不同性状发生改变。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,研究者开发出不同的分子标记方法对葡萄芽变进行鉴定,同时葡萄芽变的变异机制也有了较为深入的研究。笔者重点从葡萄的花序和果穗、果实颜色、果型、成熟期、果实无核、植株结构及倍性这些性状的变异机制进行阐述,旨在为葡萄芽变育种提供理论参考。

SO_(2)引起巨峰葡萄采后落粒的共表达网络和转录调控分析

【目的】二氧化硫(SO_(2))处理可有效防治葡萄灰霉病和采后腐烂,但会导致浆果脱落,研究SO_(2)引起葡萄浆果脱落的分子机制,明确关键基因和转录调控机制。【方法】使用SO_(2)处理‘巨峰’葡萄,分别在2、4和6 d进行采样并统计对照组(CK)和SO_(2)处理组的葡萄浆果脱落率。通过高通量测序技术对CK对照组和SO_(2)处理组‘巨峰’葡萄采后2、4和6 d的样品测序,以葡萄基因组作为参考基因组进行序列比对,利用TPM算法计算基因表达量,使用基因集富集分析(GSEA)、基因共表达网络(GCN)以及转录调控网络预测方法对转录组数据进行系统的分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对其表达量进行验证。【结果】SO_(2)处理能够显著诱导葡萄浆果脱落,2 d时,SO_(2)处理的葡萄浆果脱落率为9.88%,4 d时达到19.24%,且均显著高于对照组,6 d时脱落率达到38.25%,而对照组脱落率仅11.85%。通过GSEA分析,发现在CK组富集的GO生物过程主要与氧化应激反应、细胞壁代谢以及苯丙氨酸代谢通路相关,其中4 d时CK组富集到植物细胞壁组织、果胶代谢、细胞壁修饰、聚半乳糖醛酸等通路。在SO_(2)组富集的GO生物过程主要与能量代谢通路相关,其中2 d时在SO_(2)组富集到光合作用、四吡咯代谢、前体代谢物和能量的产生、葡萄糖代谢等通路。CK组富集的KEGG代谢通路主要有戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换、半乳糖代谢、植物激素信号转导、柠檬酸循环(TCA循环)等,SO_(2)组有光合作用、柠檬酸循环(TCA循环)、糖酵解等。GCN将GSEA分析中的领头基因分为12个水平,水平4—9均富集到了能量代谢、糖代谢相关通路,其中水平4富集到激素反应、氧化应激反应。对GCN关键水平中的基因启动子序列进行转录调控预测分析,结果显示95个转录因子(TFs)与269个靶基因存在987对调控关系。WRKY14、WOX8、KUA1在SO_(2)处理下持续下调,MYB60、MYB73、ANL2、ERF2、DOF3.6、GATA25、WRKY57、KAN2、ATHB6在SO_(2)处理后持续上调。此外,MYB15、WRKY11、WRKY33、WRKY40、WRK75先上调后下调。ERF2、MYB60和WRKY40的转录调控网络发现调控的靶基因涉及细胞壁代谢、糖代谢等相关途径。qRT-PCR结果显示PME36和ERF2上调表达趋势相似,GAUT7、MYB60、UGE3上调表达趋势相似,此外,WRKY40在SO_(2)处理的2和4 d被诱导上调,PPME1、COMT1表达持续下调,SO_(2)处理4 d时LAC15被显著诱导上调。【结论】SO_(2)诱导营养物质代谢、能量代谢、细胞壁代谢途径相关基因的表达,该过程受到多种转录因子调控,最终导致葡萄浆果脱落。

干旱胁迫下葡萄AQP基因家族的鉴定及转录调控网络预测

【目的】探究干旱胁迫下葡萄AQP的转录调控网络,为后续研究葡萄抗旱基因功能和转录调控机制提供理论依据。【方法】通过生物信息学方法分析葡萄AQP基因家族成员的理化性质、系统进化和染色体定位,进行共线性分析和转录因子调控预测,通过转录组数据分析该基因家族在干旱胁迫和脱落酸(abscisic acid,ABA)处理下的表达情况。【结果】37个VvAQP基因主要分为PIP、TIP、NIP、SIP四类,分别分布在17条染色体上,复制分析结果表明,共有5对节段复制和2对串联复制。蛋白序列分析表明,每个VvAQP蛋白序列中均有1个植物AQP主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)的保守结构域特征。通过转录调控网络预测发现,靶向VvAQP基因的转录调控因子主要分为16类。干旱胁迫下,根和叶中大部分VvAQP基因表达持续下调,VvPIP2-3、VvPIP2-6在根中持续上调,7个VvAQP基因受ABA显著诱导。干旱胁迫下15个差异表达的转录因子可能与13个VvAQP基因存在调控关系。【结论】鉴定并提供了葡萄AQP基因家族成员的基本信息,通过转录组数据发现可能参与干旱胁迫的VvAQP基因,并预测了这些基因的转录调控网络。

丁香酚-壳聚糖纳米颗粒抑制SO_(2)引起巨峰葡萄采后脱落的转录调控网络预测

【目的】探究丁香酚-壳聚糖纳米颗粒作为可食用材料对SO_(2)引起的浆果脱落的影响,筛选出抑制浆果脱落的关键候选基因。【方法】对SO_(2)和SO_(2)+丁香酚-壳聚糖纳米颗粒(SN)处理巨峰葡萄(Vitis vinifera L.×V.labrusca L.Kyoho)后贮藏2、4、6 d的样本进行转录组测序。利用GO富集、聚类分析及转录因子调控网络预测对样本间的差异基因进行分析。【结果】GO富集显示差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)参与了多糖代谢、与脱落酸激活的信号通路、细胞壁代谢相关等过程。聚类分析将DEGs分为6个Cluster,丁香酚-壳聚糖纳米颗粒处理诱导Cluster中多种类型转录因子(transcription factors,TFs)差异表达,包括乙烯应答因子(ethylene response factor,ERF)、NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)、碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)、碱性亮氨酸拉链(basic-leucine zipper,bZIP)、WRKY、Dof(DNA-binding one zinc finger)、HB-other、同源异型-亮氨酸拉链(homeodomain-leucine zipper,HD-ZIP)、MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)和MYB_related等类型。转录因子网络预测进一步揭示22个TFs与203个靶基因之间可能存在的调控关系。【结论】筛选出丁香酚-壳聚糖纳米颗粒处理抑制SO_(2)引起葡萄脱落的关键转录因子,并预测其与对应靶基因之间的调控网络图,为进一步揭示可食性包膜抑制葡萄落粒的转录调控机制奠定了理论基础。

小果型西瓜新品种华晶18号的选育

华晶18号是以01F为母本、10204-8-16为父本杂交选育而成的早熟小果型西瓜新品种。该品种在洛阳塑料大棚栽培(2月中旬育苗)全生育期90 d左右,果实发育期30 d左右。在河南、山东、陕西日光温室种植表现为易坐果,果实圆形,果皮绿色覆墨绿色齿状条带,果皮厚度0.4~0.5 cm,单果质量1.5 kg,中心可溶性固形物含量(w,下同)12.5%左右,边部10.8%左右。瓜瓤鲜红,瓤质酥脆,果皮韧。一般667 m^(2)产量2700~3000 kg。适宜于河南、山东、江苏、安徽、陕西等地种植。2019年1月通过农业农村部非主要农作物品种登记。

甲基化修饰影响果实生长发育的研究进展

果实生长发育是包括多种转录因子参与的多基因调控的复杂的生物过程,它不仅受各种植物激素的调控,还会受到不同类型表观遗传学的修饰。DNA甲基化、组蛋白甲基化和RNA甲基化是表观遗传修饰中甲基化修饰的三种不同方式。大量研究表明,这些修饰在果实生长发育过程中发挥重要作用,它们影响着基因的染色质状态,进而调控基因的表达水平。番茄、草莓、甜橙和葡萄等不同果实的研究发现,甲基化水平会随着果实的生长发育而发生动态变化,甲基化水平的变化又会促进或抑制果实的成熟。甲基化修饰在果实生长发育过程中的具体功能机制和作用途径的研究,有助于深入理解果实生长发育和成熟的调控机理,并为果实发育调控提供借鉴。本文总结了甲基化修饰影响果实生长发育的研究进展,梳理了DNA甲基化与果实生长发育研究的思路,为今后甲基化修饰与果实生长发育研究提供参考。

葡萄细胞分裂素响应调节因子VlRRA1的克隆、表达及启动子活性分析

在‘巨峰’葡萄中克隆获得细胞分裂素响应调节因子VlRRA1及其启动子,分析了VlRRA1的表达特征,并对其启动子进行活性分析。结果显示,VlRRA1的cDNA全长为666 bp,编码221个氨基酸;保守结构域预测结果显示该基因仅含有1个磷酸接受结构域(REC),属于A型RR基因;系统进化关系表明VlRRA1与其他物种中的A型RR亲缘关系较近。酵母自激活试验说明VlRRA1不具有转录激活活性,符合A型RR基因的典型特征。qRT-PCR结果表明VlRRA1具有组织表达特异性,主要在茎、叶以及幼果中表达;外源细胞分裂素氯吡苯脲(CPPU)可以促进VlRRA1的表达,而细胞分裂素生物合成抑制剂洛伐他汀(lovastatin,LOV)则抑制VlRRA1的转录。VlRRA1启动子上有多种与非生物胁迫和激素响应相关的元件。GUS组织染色的结果表明,VlRRA1启动子具有活性,可以响应多种激素信号,包括与坐果相关的细胞分裂素、生长素和赤霉素。以上结果表明VlRRA1在细胞分裂素介导的葡萄坐果与幼果发育中具有重要作用。

5-azaC对‘巨峰’葡萄果实发育阶段mRNA可变剪接的影响

DNA甲基化和mRNA可变剪接在果实发育过程中均发挥重要作用,但两者间的联系和互作关系尚不清楚。基于5-氮杂胞苷(5-azaC,DNA甲基转移酶抑制剂)处理可以使‘巨峰’葡萄成熟期提前,对5-azaC处理后的‘巨峰’RNA-seq测序,分析果实不同发育阶段发生的可变剪接事件。结果表明,3′端可变剪切位点(A3)类型在处理和对照中均最多,外显子互斥(MX)类型最少。可变剪接在不同发育阶段存在特异调节,发育前期可变剪接的调控更为频繁;鉴定到9683个发育过程中保守的可变剪接事件。在处理与对照间有671个可变剪接事件存在明显的剪接变化,功能注释显示其中有14个基因与甲基化修饰相关,表明可变剪接与甲基化修饰协同调控葡萄果实成熟过程。

甜瓜新品种‘白皮脆’

‘白皮脆’是以优良薄皮甜瓜稳定自交系299-5为母本,厚皮甜瓜抗病稳定自交系271为父本杂交选育的早熟优质甜瓜新品种。全生育期85 d,果实发育期35 d。果实长筒形,单瓜质量1.1~1.5 kg。白皮白肉,果肉厚2.0cm,果实中心可溶性固形物含量16.2%左右。抗性强,极早熟。平均产量为45.6t·hm^(-2)。适合河南、山东、北京等保护地或露地栽培。