NORAD诱导的自噬促进食管胃结合部腺癌细胞对奥沙利铂耐药的研究

目的探讨DNA损伤激活的非编码RNA(NORAD)诱导细胞自噬对食管胃结合部腺癌(AEG)奥沙利铂耐药的影响及分子机制。方法收集2023年1月至6月安阳市肿瘤医院诊治的进展期AEG患者AEG及其癌旁正常组织手术标本4对,应用长链非编码RNA微阵列芯片分析AEG及其癌旁组织中NORAD的表达情况。使用新鲜AEG组织标本制备肿瘤组织来源的AEG细胞系(PDC),构建PDC和AEG细胞系OE19的奥沙利铂耐药细胞系(PDC-R、OE19-R),并通过转染shNORAD制备敲减NORAD的PDC-R和OE19细胞系(shNORAD PDC-R、shNORAD OE19-R)。应用生物信息学工具Starbase v3.0和DIANA-lncBase v3.0预测NORAD潜在靶点及其与微RNA-433-3p(miR-433-3p)的相互作用。PDC、PDC-R,OE19、OE19-R细胞分别共转染miR-144-3p和野生型NORAD(NORAD-WT)或突变型NORAD(NORAD-Mut)质粒,应用双萤光素酶报告实验验证NORAD与miR-433-3p的相关性。通过定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测胃正常黏膜细胞系GES-1及AEG细胞系PDC、PDC-R、shNORAD PDC-R、OE19、OE19-R、shNORAD OE19-R中NORAD和miR-433-3p表达水平,蛋白质印迹法检测上述细胞p62和微管相关蛋白1轻链3 B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)的表达。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定奥沙利铂对PDC、PDC-R、shNORAD PDC-R、OE19、OE19-R和shNORAD OE19-R细胞的细胞半数抑制浓度(IC_(50))。统计学方法采用独立样本t检验。结果微阵列芯片分析发现与癌旁正常组织相比,AEG中NORAD表达显著上调(差异表达倍数≥2.0,P<0.05)。生物信息学研究发现miR-433-3p是NORAD的潜在靶点。双萤光素酶报告实验结果显示,在PDC和PDC-R细胞中,NORAD-WT组的相对萤光素酶活性低于NORAD-Mut组(0.441±0.104比0.928±0.204、0.449±0.112比0.947±0.201),差异均有统计学意义(t=-14.74、-14.94,均P<0.001);OE19和OE19-R细胞中双萤光素酶报告实验结果与PDC细胞系相同。qRT-PCR检测结果显示,NORAD在GES-1细胞中的相对表达量(1.016±0.213)低于PDC细胞(2.194±0.322)和PDC-R细胞(4.040±0.336),且在PDC细胞中相对表过量低于PDC-R细胞,差异均有统计学意义(t=-14.94、-37.21、-19.43,均P<0.001);在shNORAD PDC-R细胞中的相对表达量(0.290±0.165)则低于PDC-R细胞,差异有统计学意义(t=-49.05,P<0.001)。miR-433-3p在GES-1细胞中的相对表达量(1.017±0.248)高于PDC细胞(0.470±0.156)和PDC-R细胞(0.203±0.045),且PDC细胞中的相对表达量高于PDC-R细胞,差异均有统计学意义(t=9.15、15.85、8.11,均P<0.001),在shNORAD PDC-R细胞中的相对表达量(0.699±0.256)也高于PDC-R细胞,差异有统计学意义(t=9.37,P<0.001)。蛋白质印迹法检测结果显示,PDC-R中LC3B-Ⅱ相对表达量高于PDC细胞(0.426±0.060比0.212±0.041),shNORAD PDC-R细胞中LC3B-Ⅱ的相对表达量(0.155±0.029)低于PDC细胞,差异均有统计学意义(t=8.70、-79.45,均P<0.001);而p62在各细胞系中表现呈相反趋势,在PDC-R中相对表达量低于PDC(0.205±0.031比0.311±0.040),在shNORAD PDC-R中的相对表达量(0._(50)4±0.084)高于PDC,差异均有统计学意义(t=-31.19、62.80,均P<0.001)。在OE19细胞系的原始细胞、耐药细胞和NORAD敲减细胞中NORAD和miR-433-3p,以及LC3B-Ⅱ和p62表达变化规律与PDC细胞系相似。CCK-8评估靶细胞活力发现,奥沙利铂对PDC、PDC-R和shNORAD PDC-R细胞的IC_(50)值分别为14.28、22.27和2.51μg/mL,对OE19、OE19-R和shNORAD OE19-R细胞的IC_(50)值分别为3.95、8.12和1.89μg/mL。结论NORAD在AEG组织及细胞中呈高表达;在奥沙利铂耐药的细胞呈过表达,而且增加了细胞的自噬活性。敲减NORAD后AEG细胞自噬活性受到抑制,而且AEG细胞对奥沙利铂的敏感性增加。

热塑体膜双重标记联合开窗技术定位在乳腺癌保乳术后放疗中的应用价值

目的 比较乳腺癌患者保乳术后采用乳腺托架定位与基于热塑体膜双重标记联合开窗技术定位方式的放疗摆位误差及放射性皮肤反应,对热塑体膜双重标记联合开窗技术定位方法的可行性进行研究.方法 回顾性分析2019年1月至2020年12月郑州大学第五附属医院收治的83例乳腺癌保乳术后女性患者的临床资料,年龄(47.5±10.1)岁.根据定位方式将患者分为乳腺托架组(41例)和体膜组(42例),2组患者在放疗前通过直线加速器在机载锥形束CT(CBCT)下进行摆位验证.根据美国肿瘤放射治疗协作组制定的标准评估人组患者的急性和晚期放射性皮肤反应.摆位误差的组间比较采用t检验;计数资料的组间比较采用X^(2)检验.结果 体膜组在左右(X轴)[(2.14±0.19)mm 对(2.96±0.20)mm]、头脚(Y轴)[(2.49±0.15)mm 对(3.05± 0.16)mm]、腹背(Z轴)[(2.41±0.22)mm对(3.14±0.19)mm]方向的摆位误差明显小于乳腺托架组(t=2.98、2.63、2.49,均P<0.05);且在摆位误差≤3 mm时,Y轴方向体膜组分布比例高于乳腺托架组(72.20%对 48.78%,X^(2)=7.23,P=0.01);在摆位误差>5mm 时,X 轴(3.81%对 8.78%)、Y轴(8.78%对33.17%)、Z轴(10.95%对24.88%)方向体膜组分布比例均低于乳腺托架组(X^(2)=4.37、12.40、13.73,均P<0.05);2组患者急性放射性皮肤反应发生率(30.95%对53.66%)的差异有统计学意义(X^(2)=4.39,P=0.04).结论 基于热塑体膜双重标记联合开窗技术定位方式减小了摆位误差、减轻了急性放射性皮肤反应,具有较好的稳定性和重复性,更安全可靠,且操作简捷.