人抗P53蛋白单克隆抗体的制备及评价

目的制备获得人P53蛋白单克隆抗体,并应用于免疫组化检测。方法利用基因重组方法,将p53基因构建到原核质粒载体上并诱导表达,将收集获得的P53蛋白免疫小鼠,经细胞融合及亚克隆手段获得鼠源单克隆抗体,与商品化的抗体DO-1共同染色蜡块包埋的病理组织样本,比较二者的染色结果。结果在筛选获得的与DO-1检测结果相近的5株抗体内,取检测结果最接近的1株抗体5E10,经Protein A/G株纯化抗体,与收集获得的数例癌症组织蜡块进行免疫组化验证,发现结果均与DO-1的结果无明显差异。结论成功制备并筛选出1株人抗P53单克隆抗体,可用于免疫组化染色。

程序性细胞死亡配体1胞外区原核重组表达、纯化及其多克隆抗体制备

为制备程序性细胞死亡配体1胞外区多肽及其鼠源性多克隆抗体,根据UniProtKB数据库中公布的其胞外区基因序列(标识符:Q9NZQ7-1)和原核表达载体pET-28a(+)Nde I上游和Xho I位点下游的序列,设计合成带有同源臂的特异性引物.以合成的PD-L1胞外区基因为模板,PCR扩增程序性细胞死亡配体1胞外区基因并将其克隆至pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E,转化至大肠杆菌DH5α中,扩增并提取其质粒,然后将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达.亲和层析镍柱纯化重组蛋白后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,确认表达蛋白正确.浓缩换液后用重组蛋白免疫Balb/c品系小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测,成功获得抗程序性细胞死亡配体1胞外区血清.该研究对于研发某些肿瘤伴随诊断检测试剂有重要意义.

外周血细胞FISH快速检测反应体系的分析

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一种通过带有荧光标记的核苷酸片段,经过变性、复性结合到目的基因片段上,用以获得目的基因信息状态的技术。自20世纪80年代中后期建立以来[1],该技术得到了飞速发展,架起了细胞遗传学和分子生物学的桥梁,在血液病、产前诊断和乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌等实体肿瘤的临床诊断和治疗监测中发挥重要作用[2]。尽管相对于其他诊断方法,FISH具有诸多优势如:荧光试剂和探针经济、安全,探针稳定,一次标记后可在2年内使用且实验周期短、迅速得到结果、特异性好、定位准确,但是传统FISH仍需要过夜杂交(>16 h)以促使荧光信号能够达到判读标准[3-6]。

适用免疫组化的突触素与嗜铬素A单克隆抗体的制备与临床初步评价

目的:制备突触素与嗜铬素A免疫组化单克隆抗体,期望可初步应用于临床。方法:设计Syn与Cg A融合基因,并构建至表达载体上表达获得融合蛋白。经过抗原免疫、细胞融合后筛选获得目标抗体。通过临床样本对比验证,研究Syn和Cg A两者的特异性,评价相关系数。结果:通过筛选,共获得2株分别针对Syn与Cg A的抗体3D9和4A12。通过对比抗体试剂共同验证19种蜡块组织,统计结果分析,结果符合性较好,相关系数分别达到r=0.989 2与r=0.993 9。结论:该方法成功制备获得了可初步适用于免疫组化的突触素与嗜铬素A抗体,该方法可为免疫学抗体研究提供一定的借鉴意义。

石蜡切片在不同保存条件下抗原稳定性分析

目的采用不同的保存条件处理石蜡组织切片,检测组织切片内抗原在不同保存条件下的稳定性,从而找到合适的石蜡组织切片保存条件。方法分别将Alk、CA125、CD10、Cox2、ER、p16、p63、Her2、Pax5、PD-L1等10个抗原阳性表达的组织蜡块连续切片后,65℃烤片2 h,作为无蜡封组;蜡封组将空白石蜡切片捞取在石蜡切片组织的表面,以达到蜡封、隔绝空气的目的。将无蜡封组和蜡封组石蜡切片在室温、2~8℃和-20℃保存,并在0 h、1月、2月、3月、4月、5月、6月、7月时,使用相同批号的免疫组织化学试剂进行染色,分析不同保存条件下抗原的稳定性。另外,无蜡封组和蜡封组在37℃条件下进行2周的老化试验,以观察高温老化条件下组织切片内抗原的稳定性。结果蜡封组染色效果均差于无蜡封组。石蜡切片在保存7月时,Alk、ER、Pax5抗原项目染色明显减弱,Her2抗原阳性组织切片室温保存4月时染色已为阴性,其它抗原项目抗原虽有丢失,但免疫组织化学染色结果差异不显著。结论-20℃条件下,组织切片保存抗原稳定性最好,2~8℃条件下保存效果次之,室温保存效果最差;细胞核抗原稳定性最差;无蜡封处理的石蜡切片抗原保存效果好于蜡封处理。低温保存是储存石蜡组织切片的良好条件,但蜡封处理后的石蜡切片免疫组织化学染色弱于无蜡封组。

不同稀释液对混合酶标抗体稳定性的影响

目的 探讨不同稀释液对混合酶标抗体稳定性的影响,筛选出一种适用于混合酶标抗体的稀释液,可同时保护辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)偶联二抗和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)偶联二抗鸡尾酒混合物的稳定性。方法 以Tris-HCl缓冲盐溶液为基础溶液,设置4种不同的稀释液配方(A、B、C、D),每种配方包含不同类型的稳定剂,如蛋白、金属离子、表面活性剂、抑菌剂等,采用不同的稀释液配置混合酶标抗体,在冷藏(2~8℃)和37℃条件下存储,通过ELISA、酶活测定及免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色法检测其稳定性。结果 D液配方[Tris(50 mmol/L)+牛血清白蛋白(1.5%,g/100mL)+Tween-20(0.3%)+Proclin-950(0.1%,g/100 mL)+氯化钠(150 mmol/L)+L-Ascorbic Acid(1 mmol/L)+L-methionine(5 mmol/L)+L-histidine(5 mmol/L)+酪蛋白酸钠(1%,g/100 mL)+氯化锌(0.1 mmol/L)+海藻糖(8%,g/100 mL)]保存试剂的稳定性最好,在37℃条件下保存10周,HRP偶联二抗和AP偶联二抗的工作液效价最高,HRP和AP的活性剩余比率分别为93.46%和96.07%,IHC结果 无明显差异。结论 该配方稀释液可用于混合酶标抗体工作液的配置。