甲醛灭活工艺对By型流感病毒的灭活效果及其抗原稳定性的影响

目的评价终浓度为100μg/ml甲醛、2~8℃、10 d灭活工艺对2022年四价流感病毒裂解疫苗生产用By(B/Phuket/3073/2013/BVR-1B)病毒毒株灭活的适用性。方法病毒收获液(鸡胚病毒培养产物)经过澄清过滤,控制蛋白浓度<800μg/ml,温度2~8℃,添加甲醛溶液至终浓度100μg/ml,对病毒收获液进行灭活。在灭活第0、1、2、3、4、5、10天取样,采用鸡胚半数感染剂量(median infective dose,EID50)法检测病毒滴度,采用Reed-Muench法计算lgEID50/ml;采用直接血凝法检测流感病毒血凝滴度;对灭活10 d的样品进行病毒灭活验证试验;灭活10 d后的病毒液经超滤、离心、层析等工艺提纯,取样进行透射电镜观察病毒颗粒完整性。结果病毒收获液灭活第0、1、2、3、4、5、10天的病毒滴度分别为(8.5±0.4)、(4.2±0.5)、(1.3±0.4)、0、0、0、0 lgEID_(50)/ml,血凝滴度结果均在1∶256~1∶512;病毒灭活验证试验显示,经过10 d的灭活,病毒均已全部灭活;透射电镜观察显示,所得的病毒均为完整病毒颗粒。结论终浓度100μg/ml甲醛、2~8℃灭活10 d的灭活工艺可用于By(B/Phuket/3073/2013/BVR-1B)流感病毒的灭活处理。

H1N1型流感病毒生长曲线的测定

探究2023年由WHO公布的H1N1型毒株A/Victoria/4897/2022(AH1N1pdm09)制备的高生长重组流感病毒(IVR-238)的生长规律,为流感疫苗生产中的病毒培养时间提供指导。方法 将H1N1型流感病毒(IVR-238)接种至9-11日龄鸡胚绒毛尿囊腔内,于温度33.0~35.0 ℃、湿度45%~65%的环境下进行病毒培养,分别在不同培养时间(24 h、32 h、48 h、56 h、64 h、72 h)收取鸡胚的尿囊液,进行血凝滴度检测以确定病毒增殖情况,并依据血凝滴度检测的结果及培养时间绘制出病毒的生长曲线。结果 H1N1型流感病毒(IVR-238)滴度在24~56 h呈上升趋势,56~64 h趋于稳定,处于平稳期,在64~72 h呈下降趋势。结论 H1N1型流感病毒(IVR-238)接种鸡胚后,在24~56 h迅速增殖,病毒量在56~64 h趋于稳定,处于平稳期,在64~72 h呈下降趋势,H1N1型流感病毒(IVR-238)的最佳病毒培养时间为56~64 h。

离子交换和疏水层析法代替盐析沉淀技术精制破伤风毒素初探

目的用离子交换+疏水层析法代替传统的盐析沉淀技术制备高纯度精制破伤风毒素。方法破伤风毒素浓缩液经Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析去除杂蛋白,将收集到目标蛋白破伤风毒素经2.0 mol/L硫酸铵-磷酸盐缓冲液等量稀释后,再用Phenyl Sepharose^(TM)6 Fast Flow(high sub)疏水层析去除大部分杂质及色素制得纯度较高的精制破伤风毒素。结果用离子交换+疏水层析法纯化破伤风毒素实验重复3次,精制破伤风毒素絮状单位平均值达到3600 Lf/mL,纯度平均值为100%,精制破伤风毒素的特异蛋白条带相对分子质量分别在148000~153000、98000~103000、53000~57000范围内。与盐析法相比,离子交换+疏水层析法各项指标均有较大提高。结论离子交换+疏水层析法能有效、稳定地制备符合要求的精制破伤风毒素。在破伤风毒素的纯化中,离子交换+疏水层析法可取代传统的盐析沉淀技术。

群体倍增水平评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性

目的采用群体倍增水平(population doubling level,PDL)评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性,并进行验证,以期为该细胞工业化生产培养提供实验依据。方法将工作种子批HEK293细胞连续传代60 d,每2 d传1代,评价PDL增加至10~60时的细胞稳定性。通过相关研究结果计算获得当HEK293细胞传代培养至2500 L规模时,各代PDL应控制在2±0.2范围内。将工作种子批HEK293细胞经摇瓶(125、500、1000、3000 mL,共传4代)、细胞扩增系统(cell expansion system,CES)(25、25及50 L,共传3代)、生物反应器(100、500、500,共传3代)阶段培养,各代PDL均控制在2±0.2范围内,共培养3批,并分析细胞密度、活率、结团率、直径等指标。500 L生物反应器培养HEK293细胞72 h,按MOI=5~10接种工作种子批腺病毒,培养2 d,收获病毒培养液,检测病毒颗粒数。结果工作种子批HEK293细胞连续传代至PDL达60时仍能维持较高的细胞密度和活率。将PDL控制在2±0.2范围内,3批HEK293细胞在摇瓶、CES、生物反应器培养阶段的密度均>2.0×10^(6)个/mL,活率均>96%,细胞直径约为17μm;结团率均<35%。3批500 L生物反应器培养的HEK293细胞接毒2 d后,病毒颗粒数分别达11.68×10^(10)、12.55×10^(10)和9.38×10^(10)vp/mL。结论采用PDL评价HEK293细胞传代稳定性是可行的,可更科学地反映传代细胞的生长状态。

150 L生物反应器规模化扩增狂犬病病毒工艺的建立

目的建立150 L生物反应器大规模培养狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的工艺,为后期开发更大规模高密度微载体反应器工艺奠定基础。方法应用30 L(型号:C30-2)和150 L(型号:VESSEL FERMENTER 300L)生物反应器,以灌流方式培养Vero细胞和CTN-1V株RABV,Cytodex-1微载体浓度20 g/L,培养温度36~38℃,DO 20%~60%,pH 7.0~7.4,连续13 d收获病毒液,培养过程中取样检测细胞密度、病毒滴度,并对病毒收获液进行无菌和支原体检查及抗原、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、DNA残留量检测。结果30和150 L生物反应器的细胞培养密度均可达1.2×10^(7)个/mL以上,在培养过程中各时间点的细胞密度差异均无统计学意义(t=0.225~2.173,P=0.096~0.833)。2种规模生物反应器病毒收获液均在感染后6 d达最高病毒滴度(8.5 lgLD_(50)/mL),且差异无统计学意义(t=1.000,P=0.374)。2种规模生物反应器病毒收获液的抗原、HCP、BSA和DNA残留量基本一致。结论可用150 L生物反应器大规模培养RABV,病毒收获液符合《中国药典》三部(2020版)相关标准。