减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的:为构建减毒鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系统,并将其开发为能够稳定携带外源基因的活疫苗载体。方法:利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的等位基因交换技术,以减毒鼠伤寒沙门菌株SL1344Δsse K1为亲本株,运用二步法筛选asd基因缺失株SL1344Δsse K1Δasd。将携带有asd基因的无抗性p YA3493质粒电转至上述缺失菌株SL1344Δsse K1Δasd,构建SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)重组菌株。结果:PCR及测序结果表明SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)构建成功。进一步研究表明重组菌株SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)血清型和强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相同,且能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相比均无明显差异。小鼠毒力试验表明,SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为5.24×108CFU,毒力较强毒株SL1344约下降至0.048%;免疫保护效力试验显示,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率,与亲本株SL1344Δsse K1基本一致。结论:以上结果表明,鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株宿主-载体平衡致死系统构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。

2016年河南省猪流行性腹泻病毒S、M基因遗传变异分析

为了解目前河南省猪流行性腹泻病毒(PEDV)S、M基因的遗传变异情况,本研究于2016年1月～2017年4月从河南省不同地区的16个规模化养猪场采集到67份病死仔猪小肠病料,应用RT-PCR进行PEDV检测,选取部分PEDV阳性样品分别进行PEDV S基因部分序列和M基因全序列的扩增、克隆和序列测定,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,16个规模化养猪场67份样品中共有13个猪场的43份病料显示PEDV阳性,阳性率为64.2%,选取的13株PEDV代表株间S基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别为97.0%～99.9%和95.9%～100.0%,与经典株CV777同源性分别为94.9%～96.0%和93.6%～95.3%,与Gen Bank中登录的PEDV参考株同源性分别为92.0%～99.6%和89.8%～99.7%。13株PEDV间M基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性为98.2%～99.9%和96.0%～99.6%,与经典株CV777同源性分别为97.2%～98.2%和96.0%～98.2%,与PEDV参考株同源性分别为93.5%～99.6%和91.2%～99.1%。遗传进化分析显示,13株PEDV与中国疫苗株CV777处在不同的分群,与2016年中国福建省PEDV流行株XM1-2处于同一分支,表明河南省PEDV流行株与中国疫苗株亲缘关系较远。本研究结果明确了目前河南省PEDV的遗传变异情况,为河南省PED的诊断和防控提供了参考依据。