堆型艾美耳球虫子孢子和鸡十二指肠上皮细胞的共同抗原的研究

以抗堆型艾美耳球虫子孢子的单抗EASP-3G3作为工具,对鸡各段消化道上皮细胞切片和子孢子进行免疫组化染色,并利用蛋白质印迹技术来检测单抗所识别子孢子可溶性抗原的分子量,来确定子孢子和十二指肠上皮细胞之间是否存在共同抗原.结果表明单抗只与十二指肠上皮细胞发生反应,而与其他肠段无染色反应.而且单抗所识别的可溶性抗原分子量为35～48 ku.抗子孢子的单抗同时与十二指肠上皮细胞和子孢子反应,而不与其他肠段反应,证明堆型艾美耳球虫寄生的位点特异性与十二指肠上皮细胞表面的某种抗原分子有内在的关系.

堆型艾美球虫子孢子单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立堆型艾美球虫(Eimeriaacervulina)子孢子表面抗原的杂交瘤细胞株。方法使用纯化的堆型艾美球虫子孢子直接免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立细胞株,制备单克隆抗体。用ELISA确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、免疫球蛋白的类型和亚类,并对单克隆抗体进行鉴定。结果获得4株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中Easp-3G3、Easp-5G10为IgG1类,Easp-3H6为IgG2b类,Easp-5H4为IgG2a类。4株单克隆抗体均能与堆型艾美球虫子孢子的抗原蛋白反应,但仅Easp-5H4能与柔嫩艾美球虫子孢子抗原蛋白反应。Easp-3G3和Easp-5G10与另外2种单克隆抗体的识别位点不同,而Easp-3G3与Easp-5G10、Easp-3H6与Easp-5H4的识别位点相近。结论制备了4株堆型艾美球虫子孢子单克隆抗体。

抗堆型艾美耳球虫子孢子单链抗体的构建及表达

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载体pET28a(+)载体中进行表达,用Ni-NTA的金属亲和层析法进行纯化,通过SDS-PAGE和ELISA测定其纯度和生物学活性.电泳结果分析表明重组蛋白的相对分子量为32kDa,纯度为94%;ELISA反应结果证明该单链抗体保持了单克隆抗体的生物学特性,并能与堆型艾美耳球虫子孢子抗原发生特异性反应.

生物技术在鸡球虫免疫研究中的应用

就近几年开发的球虫疫苗和球虫免疫中所涉及的分子细胞生物学、分子免疫学和功能基因组学的相关技术进行了阐述。

乳汁中RNA提取方法的建立

用牛初乳作为试验材料,进行乳汁体细胞的提取及RNA的提取与扩增。结果显示:牛初乳中含有大量的体细胞(SCC约为20万/ml,活力约为60%),从体细胞中提取RNA,所提取的RNA完整性和纯度可以用来合成cDNA,管家基因GAPDH扩增条带正确,表明可以用合成的cDNA作为模板进行其它基因的扩增,为奶牛在基因工程方面的研究提供分子生物学技术平台。

绵羊尿鸟苷素基因的克隆与序列分析

克隆并分析了绵羊尿鸟苷素(uroguanylin)基因。根据同源序列克隆原理设计一对克隆引物,对绵羊十二指肠黏膜组织提取的总RNA进行RT-PCR,将PCR产物克隆、测序。绵羊尿鸟苷素基因与人、小鼠和猪的同源性分别为83%,77%和88%,推测的氨基酸构成一个模域。克隆了绵羊尿鸟苷素基因片断,为进一步研究绵羊尿鸟苷素基因的生物学功能提供了理论基础。

绵羊黏膜趋化因子CCL28基因的克隆、序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。

抗堆型艾美耳球虫子孢子表膜单链抗体基因的构建

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子表膜抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,再通过重叠延伸拼接(Splice overlap extension)PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至pMD18-T载体中进行测序。经测序,基因全长为744bp,编码248个氨基酸残基;经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。结果表明,成功构建了抗堆型艾美耳球虫子孢子表面蛋白抗体的ScFv基因。

抗堆型艾美耳球虫子孢子单抗对阶段特异性抗原的识别

为了用针对堆型艾美耳球虫子孢子的5株单抗检测各代裂殖子的反应性,分别用甲醇、丙酮、戌二醛和自然干燥等4种固定方法处理裂殖子,观察其对染色结果的影响;并运用免疫荧光技术(IFA),对单抗和裂殖子进行染色。结果显示,5株单抗中,单抗Easp-3H6和单抗Easp-5G10识别堆型艾美耳球虫裂殖子的抗原位于裂殖子的顶端,单抗5B4对各阶段裂殖子有较弱的反应,而单抗Easp-3G3和5G7不与堆型艾美耳球虫任何一代的裂殖子发生反应,表明鸡堆型艾美耳球虫的侵入阶段存在共有抗原,即种内各发育阶段的抗原。

绵羊Granulysin在大肠杆菌中的表达与鉴定

根据GenBank中公布的绵羊Granulysin基因序列设计引物,用PCR法从重组质粒中扩增出含BamHI/XhoI酶切位点的Granulysin片段,双酶切后克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX-Granulysin,转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白分子量约为41 kDa,并以包含体形式存在。

绵羊鸟苷素基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列．本试验克隆并分析了绵羊鸟苷素基因．从绵羊十二指肠黏膜组织中提取总RNA·利用设计的引物进行RT-PCR扩增，PCR产物与pMD19-T载体连接后转化到E．coli JM109感受态细胞，检测阳性克隆并测序．结果表明：克隆的绵羊鸟苷素基因长341bp，编码109个氨基酸．与人、豚鼠、小鼠和牛的同源性分别为77％、75％、47％和94％．推测的氨基酸序列信号肽为l～16aa．整个氨基酸构成一个模域．编码鸟苷素前体蛋白．