1株具有抑菌和氨氮降解功能的海洋放线菌筛选与鉴定

以副溶血弧菌、创伤弧菌为指示菌,采用牛津杯法测定37株海洋放线菌菌株无菌发酵液的抑菌作用,筛选出抑菌作用较强的菌株并测定其抑菌谱;将抑菌作用较强的菌株接种到氨氮质量浓度为50 mg/L的培养基中发酵7 d,采用靛酚蓝分光光度法测定不同菌株发酵液中的氨氮质量浓度,筛选出兼具抑菌和降解氨氮功能的放线菌优良菌株;通过形态学观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析,对筛选出的优良菌株进行种类鉴定。结果表明,15株放线菌对副溶血弧菌和创伤弧菌均具有抑制作用,其中菌株F28的抑菌作用最强,对副溶血弧菌和创伤弧菌的抑菌圈直径分别为(31.57±0.63)mm和(18.93±0.92)mm,且该菌株对供试的10种病原菌均有较强的抑制作用,抑菌谱较广;菌株F28具有氨氮降解能力,降解率为46.86%;结合抑菌作用测定结果,认为菌株F28兼具抑菌和降解氨氮功能,具有潜在的开发应用前景。初步鉴定F28菌株为梅久兰链霉菌。

暗纹东方鲀耐寒相关基因CIRBP、HMGB1和AFP-Ⅳ的分子特征和对低温胁迫的响应

为了探索暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)对低温环境的响应机制,克隆了暗纹东方鲀耐寒相关基因CIRBP、HMGB1和AFP-Ⅳ的cDNA序列,并进行了基因的分子特征和功能分析。组织分布检测显示CIRBP和HMGB1在下丘脑、肝脏和肌肉中具有高表达,而AFP-Ⅳ则主要在肝脏中表达。在受到低温胁迫后,3种基因在肝脏和下丘脑中的表达呈现不同的变化趋势,其中CIRBP基因在肝脏中于48h表达量显著增加,在下丘脑中于12h和48h有上调表达;HMGB1基因在肝脏中呈现逐渐上升的趋势,于48h达到最大值,而在下丘脑中呈现先上升后下降的趋势,处理后2h达到最大,2—8h下降,于8h下降至最低,随后恢复至初始水平;肝脏中的AFP-Ⅳ在0—24h无显著变化,在48h上升至最大值。进一步通过大肠杆菌原核表达系统研究了AFP-Ⅳ的抗冻功能,发现AFP-Ⅳ融合蛋白在–80℃下具有抗冻活性,并且抗冻活性随着浓度的增加而提高。研究结果表明3种基因都参与了暗纹东方鲀对低温胁迫的应答过程,为深入探索暗纹东方鲀的耐低温机制奠定了基础。

含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌毒力的影响

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性革兰氏阴性菌,广泛分布于海洋环境中,能够引起肠胃炎、伤口感染以及败血症,是人类重要的病原菌之一。宿主体内被认为是一种低铁环境,能够激发致细菌的毒力。副溶血弧菌能够分泌弧菌素或利用外源铁载体来获取铁。在低铁条件下,编码双组份调控系统的基因簇VPA0148-VPA0149转录上调,使含铁肠杆菌素受体PeuA转录出有活性的蛋白。VPA0148编码产物为一个响应调节因子,具有一个磷酸基团接收结构域和一个DNA结合结构域。本研究发现,VPA0148的缺失增强了菌株的生物膜形成能力和对斑马鱼的致死能力,同时能够促进菌株在低铁环境中的生长,并增强菌株的群集运动。研究结果表明含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌致病力具有调控作用,增进了对铁调节副溶血弧菌毒力机制的认识。

哈氏弧菌345Ⅲ型分泌系统诱导鱼类细胞凋亡和变圆

【背景】哈氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性细菌,也是海洋动物的重要条件致病菌之一。Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretionsystem,T3SS)是革兰氏阴性致病菌中保守存在的毒力装置,已被公认在细菌致病过程中起着关键作用。【目的】探索哈氏弧菌T3SS诱导鱼类细胞死亡的机制。【方法】采用基因敲除和回补手段获得了T3SS功能缺失的哈氏弧菌345的缺失突变和回补株。利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色、原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartatespecific proteinase, Caspase)活性测定和lactate dehydrogenase (LDH)释放测定等技术揭示哈氏弧菌T3SS导致的细胞死亡特征。【结果】哈氏弧菌345依赖T3SS能迅速导致鱼类细胞变圆并脱落,细胞核皱缩,部分细胞呈现DNA片段化、形成凋亡小体,细胞凋亡关键分子Caspase-3被激活;此外,哈氏弧菌T3SS还导致鱼类细胞的细胞膜通透性改变,LDH等内容物被释放,并且抑制凋亡途径的激活并不能阻止细胞内容物的释放和细胞变圆。【结论】哈氏弧菌利用T3SS体外诱导鱼类细胞发生细胞凋亡途径的激活和细胞变圆,最终导致细胞发生死亡。

江苏水产养殖区拟态弧菌种群结构及遗传多样性

【背景】拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种常见的革兰氏阴性病原菌,广泛分布于水环境和水生动物体内,可导致多种水产动物和人类感染。多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)已被应用于多种病原菌的分子分型,其通过分析不同菌株之间的遗传关系,监测细菌传播的时间和地理分布,确定感染和传播途径,但目前未见有关拟态弧菌MLST的报道。【目的】开发一种基于MLST的拟态弧菌分型方法,并用于江苏水产养殖区拟态弧菌的种群结构和遗传进化分析,为拟态弧菌感染所引起的疾病防治提供理论基础。【方法】选择拟态弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、mdh、recA、rpoD、pntA和pyrH作为靶点,对江苏水产养殖区分离的155株拟态弧菌进行PCR扩增和测序。将测序结果分配等位基因,制作等位基因谱,分配不同的序列类型(sequence type,ST),利用软件goeBURST-1.2.1和MEGA-X对分配的ST型进行克隆复合体和遗传进化树聚类分析;此外,利用Kirby-Bauer圆盘扩散法测试155株拟态弧菌的药敏特性。【结果】155株拟态弧菌被分为56个STs,其中ST11占比最高;在双位点变异(double locus variants,DLV)水平分析发现56个STs分为3个克隆复合体和3个单体;系统发育树显示,56个STs被分为3个集群(cluster Ⅰ、cluster Ⅱ、cluster Ⅲ)。药敏结果显示,155株拟态弧菌对红霉素类抗生素的耐药性最高(88.39%,137/155),对氯霉素类抗生素敏感性最高(91.61%,142/155)。【结论】本研究建立的MLST方法具有良好的分辨率,可作为拟态弧菌系统发育和未来流行病学调查有用的分子分型工具。根据抗生素耐药谱结果,提示在养殖过程中可选用氟苯尼考等国家批准使用的专用抗菌药对拟态弧菌进行防治。