蛋白酶SpP1基因克隆、表达及酶学性质的表征

【目的】对螺旋藻来源的一个蛋白酶基因进行克隆、表达,并探究重组酶酶学性质,为藻类蛋白酶的深入研究奠定基础。【方法】从钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)基因组扩增获得了蛋白酶基因SpP1,进而构建pET28a-SpP1重组质粒,将其转入Escherichia coli BL21(DE3)实现了异源表达,利用镍柱分离纯化重组蛋白酶并研究其酶学性质。【结果】螺旋藻蛋白酶SpP1属于丝氨酸蛋白酶家族成员,分子量为47.04 kD,最适温度和pH值分别为50℃和8.0。其热稳定性较差,在pH=8.0-9.0的范围内具有良好的酸碱稳定性。以酪蛋白为底物时,最大反应速度V_(max)=8.237 U/mL,米氏常数K_(m)=16.369μg/mL。Mn^(2+)对其具有较强的激活作用,添加0.1 mol/L Mn^(2+)后其酶活提高了18倍,同时0.1 mol/L的Fe^(3+)、Zn^(2+)、Ca^(2+)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)等对酶活也具有明显的促进作用。【结论】螺旋藻来源的蛋白酶SpP1具有丝氨酸蛋白酶家族成员的典型结构和性质特征,具有较好的酸碱稳定性,添加金属锰离子可有效提升其催化活性。

模式蓝藻FNR蛋白的生物信息学及进化分析

FNR蛋白是蓝藻光能转换和能量代谢中的核心蛋白质,为了掌握该蛋白的生物信息学信息及其进化关系,选择具有研究和应用价值的7种模式蓝藻来源的FNR蛋白作为材料,以氨基酸序列为基础,采用ProtParam、Sompa、SWISS-MODEL及MEGA11等生物信息学工具对蓝藻FNR蛋白的结构、功能及进化关系进行分析。结果表明:蓝藻FNR蛋白均属于胞内表达的单亚基蛋白,无信号肽,无跨膜结构域。其氨基酸数目在370-440个之间,分子量在45 kD左右,理论等电点在5.5-6.0之间,不稳定性指数在40%左右,蛋白序列中存在保守的FAD及NADPH结合结构域及C末端的RWHVETY保守基序。蛋白的二级结构元件中,α-螺旋和β折叠比例在20%-30%之间,无规卷曲比例较高,普遍在47%左右。FNR蛋白的三级结构具有高度的结构相似性,蛋白质的N端普遍存在一段无序的无规卷曲结构,且暴露于蛋白质核心结构外侧。进化分析表明蓝藻FNR蛋白属于独立的进化分支,与高等植物来源的FNR蛋白的亲缘关系更近。本研究结果有助于深化对FNR蛋白的结构和功能的理解,同时也为FNR蛋白在藻类合成生物学的研究和应用提供参考。