二代测序技术及其在法医遗传学中的应用

从DNA指纹图谱到STR复合扩增检验,30年来法医DNA工作者目睹着技术的深刻变革以及在此推动下案件侦查模式的巨大转变。自从二代测序技术问世以来,遗传学的研究方式已发生了巨大转变。但是相比其在癌症和遗传病诊断、基因组从头测序和重测序、转录组重测序、药物研制等领域的应用,二代测序在法庭科学领域的应用尚处于起步阶段。本文介绍二代测序的基本概念、发展历史和工作原理,综述了二代测序技术在STR分型、SNP分型、线粒体全基因组测序等几个重点领域近两年的最近动态,最后结合二代测序在法庭科学领域的应用展望提出可能遇到的挑战,希冀对相关研究和实践提供参考。

微单倍型遗传标记研究新进展及其在法医混合DNA分析中的应用

微单倍型是2013年被引入法庭科学领域的一类新型遗传标记。由于其遗传多态性优于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)遗传标记,且不像短串联重复序列(short tandem repeat, STR)遗传标记一样受到影子峰的干扰,微单倍型在法医混合DNA分析中具有显著优势。本文作者更新梳理了微单倍型的检测方法,综述了各团队筛选微单倍型基因座的情况和基于二代测序检测体系的研究现状,介绍了微单倍型数据库、数据分析软件和系统命名法,并着重分析了微单倍型在混合DNA鉴定中的优势以及最新应用研究进展,最后对微单倍型未来发展进行展望,希冀为相关研究和应用提供参考。

微单倍型遗传标记及其法医遗传学应用

微单倍型是一种国际广泛关注的新型法医遗传学分子标记。它兼具STR和SNP遗传标记的优势,在法医混合DNA检验、种族地域推断、复杂亲缘关系分析等领域均具有重要应用前景。本文综述了微单倍型遗传标记的基本概念、命名规则,回顾了二代测序、高分辨熔解曲线、单链构象多态性分析等微单倍型检测手段,介绍了微单倍型法医遗传学应用的相关研究进展,并对微单倍型遗传标记未来发展做了展望,提出了其可能面临的挑战。

死后生物化学分析在法医学死因鉴定中的研究进展

死因鉴定是法医实践中的重要内容。死后生物化学分析现已成为法医学死因鉴定的重要辅助分析手段,具有操作简便、检验效率高、便于了解死亡机制等优势。本文就死后生物化学分析方法的发展现状、自身优势及存在问题进行综述,并通过提出可行的解决办法,探讨死后生物化学分析方法在法医学死因鉴定研究中的应用前景,以期为该问题的解决提供新的研究思路。

江苏常熟地区汉族人群47个微单倍型的遗传多态性及遗传结构分析

目的探索江苏常熟地区汉族人群在47个常染色体微单倍型基因座的遗传多态性,评估应用效能及法庭科学参数。方法采用MHSeqTyper47混合DNA鉴定试剂盒进行基因座复合扩增及文库构建,使用MiSeq FGx测序平台进行测序,测得的数据应用MHTyper数据分析软件进行分析,对获得的样本遗传信息进行评估,结合千人基因组数据(1000 Genomes Project phase 3,1KG)评估群体间遗传分化指数及遗传距离,并计算法庭科学参数。结果江苏常熟地区汉族人群与1KG中的中国北京群体的遗传分化和遗传距离最小,并得到最接近的有效等位基因数(Ae),累积随机匹配概率(combined matching probability,CMP)与1KG中东亚参考人群的5个群体均接近,为1.25×10^(-36),累积非父排除概率达0.9999999999641。结论本研究报告了47个微单倍型基因座在江苏常熟地区汉族人群中的等位基因频率及遗传多态性信息,为47个微单倍型在法医学应用中提供了数据基础。另外,比较了1KG参考人群与江苏常熟地区汉族人群的多态性差异,并揭示了47个微单倍型在江苏常熟地区汉族人群中的遗传结构。总的来说,1KG中的东亚人群参考数据更符合江苏常熟地区汉族人群的遗传特征。

基于高密度SNP数据的东亚人群遗传结构研究

目的东亚疆域辽阔,民族众多,有着广泛多样的语言。中国34个省级行政区可划分为7个地理分区,人群主要分属世界七大语系。已有研究主要集中在东亚人群的起源、迁徙、融合等遗传历史。本文基于5147份世界人群个体的高密度单核苷酸多态性(SNP)数据,从地域及语言两个角度研究东亚人群尤其是中国人群与世界其他人群的遗传关系,研究中国人群的遗传关系和遗传结构。方法收集了5147份世界人群个体的高密度SNP数据,并对其进行质控、合并。通过频率差异分析方法对最终获得的32789个SNP进行统计学检验,并进一步使用主成分分析、系统发育树、祖先成分分析和D检验统计等方法,对东亚人群与世界其他人群的遗传关系,以及中国人群的遗传关系和遗传结构进行研究。结果研究发现东亚人群与非洲、美洲和欧洲人群存在显著差异。中国人群可分为7个亚群,不同人群间的遗传聚类与其地理分布、语系语族和族源历史有很强的相关性。结论本文研究了中国人群与世界人群的遗传关系和差异,并系统研究了中国人群的遗传亚结构。这将丰富东亚人群的群体遗传学、法医遗传学等研究基础,为个体化医疗等工作提供数据支撑。

法医SNP系谱推断技术助破23年冷案1例

1案例1.1简要案情23年前,某镇一女性被强奸杀害。检验死者阴道擦拭物,获得一男性常染色体STR分型,多年一直未找到嫌疑人。为进一步增加位点信息,当地公安重新检验该样本,获得41个Y-STR分型,比中安徽、江苏、山东、江西、湖北、湖南等地280个家系,其中0个基因座容差家系9个、1个基因座容差家系142个、2个基因座容差家系129个,覆盖9千余人。当地公安先后检验985份血样均未比中嫌疑人及其近亲属。本鉴定中心指导办案单位筛选72份家系样本(其中0个基因座容差14份,1个基因座容差58份),使用法医SNP系谱推断技术进行家系比对。

piRNAs在法医学体液鉴定中的能力评估

本文探究9个非编码Piwi-interacting RNA(piRNA)分子在法医常见体液中的表达差异,利用统计学方法评估靶标分子的体液区分能力,为法医学中常见体液(斑)鉴定提供方法补充。研究收集120份法医常见的人源体液样本(包括外周血、月经血、精液、唾液和阴道分泌液),采用实时荧光定量PCR法检测5种体液中靶标piRNAs分子的表达,并用Genorm、NormFinder、BestKeeper软件和ΔCt四种方法评估3种内参的稳定性,分析其在各体液中的相对表达量ΔCq的差异性,筛选出9个可用于体液区分的标记分子。针对当前法医唾液和阴道分泌液区分的难点问题,本研究利用多分子组合建立支持向量机分类模型(support vector machine,SVM)实现唾液和阴道分泌液的鉴定。此外,通过检测模拟案件样本中piRNAs的相对表达量变化评估该类小分子的稳定性。本研究筛选出9个可用于体液斑迹鉴定的标记分子,利用其中3个piRNAs分子piR-33151、piR-31662、piR-31925组合,建立起SVM分类模型可用于唾液和阴道分泌液的有效鉴别,准确性可达100%。3个分子在室内晾干12个月或紫外照射48 h的样本中仍可检测出。本研究结果表明:piRNAs分子在不同体液中的相对表达具有显著性差异,具有鉴别法医学中常见体液类型的能力,建立的分类模型可高效准确地区分唾液、阴道分泌液,具有较大的应用潜力。

中国内蒙古地区蒙古族人群的遗传推断模型构建

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)常用作法医遗传学个体识别和族群推断的遗传标记。本研究基于中国内蒙古地区蒙古族163份样本和国内其他13个人群777份样本全基因组SNP数据,使用PLINK和ADMIXTURE软件研究人群遗传结构,使用PLINK软件进行全基因组关联分析(Genome Wide Association Studies,GWAS)筛选蒙古族特异性SNP位点。使用DAA软件计算参考人群和7个国内测试人群569份样本的群体匹配概率、似然比及祖先成分等结果,以对推断模型进行准确性评估。人群遗传结构分析结果显示蒙古族人群以东亚北方成分为主,与阿尔泰语系的其他人群聚类最近。最终共筛选出644个蒙古族特异性祖先信息SNP(ancestry informative SNP,AISNP)位点。参考人群中,蒙古族的推断准确性为98.16%,其他人群为100%。测试人群中,蒙古族的推断准确性为86.67%,其他人群为96.15%~100%。研究表明蒙古族人群与东亚其他亚人群存在遗传结构差异,筛选出的644个AISNP位点可对蒙古族人群与东亚其他亚人群进行遗传推断区分,对提升东亚地区亚人群的分辨力具有重要意义。

基于二代测序技术的多源遗传标记检测体系的构建与验证

近年来,法医实践中对复杂亲缘关系的鉴定需求越来越多,需要联合多种遗传标记进行判断,如STR、X/Y遗传标记、SNP、线粒体DNA等。二代测序技术可以将多种遗传标记纳入一个检测体系中。本文报道了开发出的一套包含29个常染色体STR、36个Y-STR、32个X-STR、71个Y-SNP以及mtDNA全基因组的检测体系DNATyperTMNGSPanel v1.0。根据DNA分析方法科学工作组(SWGDAM)的验证指南,对该体系的重复性、准确性、一致性、灵敏度、混合样本、物种特异性等指标进行了评估。结果表明,该体系分型结果与毛细管电泳的一致性为99.72%,与ForenSeq™DNA Signature Prep Kit试剂盒相重合的基因座结果均完全一致。在0.5~10 ng DNA模板量范围内无等位基因丢失,而在0.25、0.125 ng时分别出现2、9个基因座的丢失。在男女混合比例为2:1时女性成分开始出现等位基因丢失,混合比例为9:1、4:1、2:1、1:1时,检出率分别为54.72%、81.13%、98.11%、100%,若男女混合比例为1:4则男性成分开始出现等位基因丢失,当混合比例为1:1、1:2、1:4、1:9时检出率分别为100%、100%、90.24%、82.93%。该体系对猪、牛、鼠、食蟹猴、恒河猴的DNA几乎没有扩增发生。因此,本体系的检测通量高,灵敏度和稳定性高,分型准确性和重复性好,对混合样本的检出能力较强。通过单次检测就可同时获得父系、母系相关的遗传信息,能有效提高个体识别能力和亲权鉴定效能。

微流控技术在法医DNA快速检验方面的应用

微流控芯片技术因其微型化、自动化、高通量、集成化、快速等优势使得实验室研究产生革命性的变化,并在生物化学、医学等诸多领域得到广泛应用,但目前还没有基于微流控芯片技术的国产全集成自动化DNA分析仪。该文总结微流控技术在DNA提取、PCR扩增、电泳分离等DNA检验流程方面的研究现状与进展,尤其是在法医DNA快速检验方面的研究进展,同时介绍国内外全集成式DNA分析的研究状况。全集成与功能化是目前微流控技术研究的主流方向。未来,以微流控芯片为主导的全自动、便携式、集成化的DNA分析系统,将使得法医DNA检验从实验室走进案件现场甚至日常生活,实现真正的快速即时检验。

法医SNP系谱推断技术破获古汉墓被盗案1例

1案例1.1简要案情和前期检验2016年3月,山西某镇古汉墓被盗,现场提取嫌疑人遗留烟蒂1枚,检出嫌疑人常染色体STR分型,但未比中人员。由于当地当时未建立男性家族排查库,故未对Y-STR分型进行检验。2020年7月,检验烟蒂获得Y-STR分型,录入男性家族排查系统,比中案发地附近刘姓、马姓等8个家系共计17人(其中3人分型一致,3人有2个位点分型不一致,11人有3个位点分型不一致)。检验男性家族排查库中人员血样的常染色体STR,与嫌疑人未比中,故使用法医SNP系谱推断技术对家系进行排查。

法医系谱分析研究进展

法医系谱分析是通过全基因组SNP数据计算两两个体的共祖片段长度,进而预测父系和母系的多级亲缘关系的技术。美国警方使用该技术破获了40多年前的金州杀手案,被《科学》杂志评为2018年全球十大科学突破之一。相比传统法医STR家系搜索和亲缘关系比对技术,该技术搜索的家族范围更广,故其迅速成为了案件侦查尤其是疑难案件侦破的重要手段。本文综述了共祖片段系谱分析技术原理和国内外研究现状,并探讨了该技术未来的研究重点,以期加速国内领域对该技术的研究,推进该技术在刑事侦查、司法鉴定中的应用。

法医SNP系谱推断技术助破14年久冷案

男性家族排查是目前法医DNA办案工作中的重要手段,但是同一父系几或十数代男性的Y-STR基因分型可能都相近甚至一致,若在全国范围内很可能比中不同地区的多个家系,当无法甄别所有比中家系与嫌疑人的亲缘关系远近时,办案单位就很难确定重点调查家系,而全部摸排则费时耗力。近期,公安部物证鉴定中心研发出了法医SNP系谱推断技术,通过检测和分析全基因组数据,可预测父系和母系的1~7级亲缘关系(高祖至玄孙,即五服),且能分析关系远近。将该技术与族群分析运用于一起长达14年未破的强奸杀人案,帮助办案单位确定了嫌疑人的地域来源、所在家系等信息,为案件的侦破提供了关键技术支撑。

单细胞分离检验技术在法医学中的应用研究

法医单细胞分离检验技术是微量混合DNA样本检验最有效的方法之一。常规的单细胞分离检验技术包括单细胞分离、单细胞裂解、PCR扩增、数据分析。本文将详细介绍单细胞分离检验技术原理和应用进展,同时展望了单细胞测序在法医DNA的应用前景。近5年来,单细胞分离、全基因组扩增和二代测序技术的结合而产生的单细胞测序技术,将为法医遗传学检测提供一种全新的技术和思路,尤其为微量混合生物样品检验提供全新的技术手段。

精准医疗时代的法医表型特征分子刻画研究进展

伴随全基因组测序、大数据等新技术发展,各国纷纷建立大型人群队列,作为一项重要的战略资源服务精准医疗等研究,相关工作显著促进了医学、生物学等领域的研究进展,催生了基因检测产业。在法医学领域,族群、系谱、体貌等特征刻画技术应运而生并迅速发展,与传统的法医DNA技术相比,新技术作用凸显"刻画搜索和提供线索",迅速成为冷案积案等疑难案件侦破的重要手段。本文对精准医疗背景下,国内外大型人群队列的建设、法医表型特征分子刻画技术研究等情况进行综述。

49AISNP:东亚北方三个族群遗传来源推断

样本的族群来源推断在法医调查中可发挥重要作用,一个理想的推断体系是用一组较少的遗传标记实现较高的族群推断准确性。本研究调研搜集了区分东亚北方三个族群北方汉族、日本人和韩国人的428个祖先信息SNP(ancestry informative SNP,AISNP),获取了其在三个族群307份样本中的分型,通过位点Fst值及等位基因频率聚类等信息进一步精简位点,最终得到了一组49AISNP组合。基于307份样本利用留一法对49AISNP进行推断准确性验证,结果表明其在北方汉族、日本和韩国族群中的推断准确性均高于99%。49AISNP组合将有助于东亚地区亚族群的进一步区分。

miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

针对微量细胞样本进行细胞核和线粒体基因组同步快速分离的方法研究

开发了一种针对微量细胞样本进行细胞核和线粒体基因组同步快速分离的方法。该方法首先利用体积分数1%非离子型表面活性剂NP-40能够选择性破坏细胞膜而维持细胞核完整性的特征,实现了细胞的轻柔裂解和细胞核完整性的维持;其次通过差速离心,实现细胞核(核基因组)与线粒体基因组的同步分离。经过显微成像观察,核酸蛋白分析仪检测以及PCR分析,实现了从10^(2)到10^(6)个悬浮培养细胞中高质量线粒体基因组的分离纯化。本方法获取的线粒体基因组无核基因组污染,为后续开展线粒体群体遗传分析、线粒体疾病诊断提供了一种高效、快速、低成本的解决方案。

线粒体全基因组测序在法医学中的应用

线粒体DNA检测是法医DNA检验的重要手段之一。随着分子生物学和计算机技术的发展,二代测序技术的出现,使得线粒体DNA检测从传统的部分测序进入到全基因组测序时代。相对于部分测序,线粒体全基因组测序能够提供更全面的序列信息,提高线粒体DNA检测的识别率;同时也能够通过对全基因组信息的深入分析,获得样本来源信息。本文介绍了经典以及新出现的线粒体DNA测序策略,简述了各种测序策略的优缺点,在此基础上重点介绍了线粒体全基因组测序在法医遗传学、线粒体相关疾病、衰老机制等方面的研究和应用,最后探讨了线粒体全基因组序列分析在法医遗传学实践中应用的可能性以及可能面临的一些问题。