AAV介导NGF过表达载体转染BMSCs对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型保护作用

目的干细胞是当前研究的热门领域,利用干细胞定向分化作用可以促进神经损伤修复,但是干细胞具有分化方向不定和易老化的特点。本研究探究腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型的保护作用。方法分离和培养人源BMSCs,采用流式细胞仪检测BMSCs的CD29,CD45和CD90等表面蛋白表达。采用免疫组织化学染色鉴定BMSCs表面CD34和CD44表达。AAV腺病毒构建NGF过表达质粒,通过高强度聚焦超声制备SD大鼠坐骨神经损伤模型,根据处理方式不同,将SD大鼠分成空白对照组,模型组,BMSCs组和NGF过表达组。利用HE染色,电镜方法观察坐骨神经形态,示踪金染色观察神经接头的聚集,TUNEL染色检测细胞凋亡,RT-qPCR检测NGF和caspase-3mRNA表达。结果流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白,CD29阳性率为98.03%,CD90阳性率为96.92%,CD45阴性率为77.2%,共表达CD29、CD90且CD45表达阴性的细胞数占总细胞数的96.89%。BMSCs细胞表面CD34和CD44免疫组织化学染色呈阳性。慢病毒转染效率>90%,转染效率较高。HE染色结果中模型组大鼠坐骨神经有明显断裂,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组裂痕缩小,而NGF过表达组断裂处几乎不可见。电镜结果显示,模型组大鼠坐骨神经密度少,且形态不规则,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组密度大,且周边为纤维组织填充,NGF过表达组大鼠坐骨神经密度大,排列较为规则。示踪金染色显示NGF过表达组神经接头处可见神经聚集。RT-qPCR结果显示空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组NGF mRNA相对表达量分别为1.18±0.05、0.77±0.06、1.75±0.07和3.09±0.08,F=9.082,P=0.019;空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组caspase-3mRNA表达量分别为2.03±0.09、5.05±0.23、3.12±0.09和1.23±0.22,F=9.177,P=0.011。空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组细胞凋亡率分别为(9.34±0.32)%、(31.24±3.43)%、(22.09±2.66)%和(4.97±1.05)%,F=9.664,P=0.014。结论腺病毒介导NGF过表达质粒转染BMSCs可以促进坐骨神经损伤大鼠坐骨神经修复,其机制可能是通过升高NGF mRNA,降低caspase-3mRNA水平实现。

低强度脉冲超声促进BMSCs定向分化对兔软骨缺损影响研究

目的膝关节内关节面软骨缺损是临床常见病,其治疗主要集中膝关节镜下滑膜清理联合微骨折处理,但对于缺损较大的患者,效果不佳。本研究探究低强度脉冲超声促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)定向分化在兔软骨缺损模型中的修复作用,以期为临床上利用超声技术对骨缺损的治疗提供新思路和方法。方法以健康清洁级新西兰大白兔为研究对象,提取和培养兔源性BMSCs,采用免疫荧光染色和流式细胞仪鉴定BMSCs,构建新西兰大白兔膝关节软骨缺损模型。根据处理方案的不同进行分组,BMSCs组单纯膝关节注射BMSCs细胞,超声组利用低强度脉冲超声进行处理,联合组利用低强度脉冲超声技术联合膝关节注射BMSCs细胞,对照组未做处理。采用组织大体学方法和Micro-CT检测软骨缺损的修复情况。采用HE、番红染色和Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)及多聚蛋白多糖(Aggrecan)免疫组织化学染色检测软骨缺损模型。采用RT-qPCR定量检测CollagenⅡ及Aggrecan mRNA表达水平。结果兔膝关节软骨缺损修复组织Ramallal评分结果显示,处理6周后联合组评分为(7.69±0.71)分,高于对照组的(2.89±0.34)分,F=9.389,P=0.016;12周后,联合组评分为(10.22±0.69)分,高于对照组的(4.11±0.46)分,F=9.786,P=0.019。HE和番红染色结果显示,处理6周联合组评分分别为(7.7±0.3)和(4.5±0.9)分,高于对照组的(5.9±0.7)和(1.4±0.2)分,F值分别为9.987和10.981,P值分别为0.021和<0.001;12周后,联合组评分分别为(8.7±1.1)和(5.6±0.6)分,高于对照组的(6.0±0.5)和(1.5±0.2)分,F值分别为14.076和18.008,均P<0.001。免疫组织化学染色结果显示,处理6周联合组CollagenⅡ和Aggrecan相对表达量分别为3.3±0.9和3.6±1.1,高于对照组的1.1±0.1和1.7±0.5,F值分别为15.116和19.987,均P<0.001;12周后,联合组分别为4.7±1.6和5.3±1.2,高于对照组的1.2±0.3和1.8±0.7,F值分别为19.221和16.654,均P<0.001。RT-PCR结果显示,处理6周联合组CollagenⅡ和Aggrecan的相对表达量分别为5.1±0.7和6.2±1.3,高于对照组的1.0±0.1和1.0±0.4,F值分别为9.001和19.177,P值分别为0.019和<0.001;12周后,联合组分别为5.9±1.2和5.9±1.3,高于对照组的1.4±0.2和1.2±0.1,F值分别为17.057和16.097,均P<0.001。结论低强度脉冲超声技术联合膝关节注射BMSCs细胞可以促进BMSCs向软骨细胞分化,促进软骨缺损的修复。

肾移植排斥患者肠道菌群变化的研究

目的研究肾移植术后排斥患者肠道菌群变化的特点。方法比较肾移植术后排斥患者及未排斥患者肠道菌群的变化,分析肠道菌群与肾移植排斥反应的相关性;以肾功能相关指标:肌酐(Scr)、尿素(BUN)、胱抑素C(Cys-C)、移植肾超声、移植肾穿刺活检评估肾脏移植患者排斥反应状态;检测患者淋巴细胞对供者骨髓源性树突状细胞(DC)刺激的反应,评价肾移植术后患者的免疫反应功能。结果肾移植术后,排斥患者粪便中类杆菌含量[(5.53±0.74)CFU/g]明显少于未排斥患者[(6.84±1.66)CFU/g](P<0.05);双歧杆菌数量、肠球菌数量与肾移植患者尿素水平相关(r=-0.482,P=0.027;r=0.439,P=0.046);类杆菌数量与肾移植患者尿素、肌酐、胱抑素C相关(r=-0.457,P=0.037;r=-0.515,P=0.014;r=-0.463,P=0.035)。排斥组患者的淋巴细胞对供者骨髓源性树突状细胞刺激的强度显著高于未排斥组(P<0.05)。结论肾移植术后排斥反应患者肠道菌群发生了显著改变,并与肾功能指标密切相关,此发现为合理应用抗排异药物、抗生素以及微生态制剂提供了理论依据,或可为减轻移植排斥提供新的思路和手段。

糖尿病下肢血管病变患者血清MMP-9和TGF-β1表达意义研究

目的 2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)下肢血管病变(lower-extremity arterial disease,LEAD)是在T2DM基础上发生的下肢动脉粥样硬化,基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)和转化生长因子β1(transforming growth factor 1,TGF-β1)与动脉粥样硬化密切相关。本研究分析T2DM的LEAD患者血清中MMP-9和TGF-β1表达临床意义,为T2DM患者LEAD防治提供依据。方法选择2016-08-05-2018-03-30泰安市第四人民医院内分泌科收治的T2DM患者80例,根据下肢超声结果,分为无下肢血管病变(non-lower extremity arterial disease,NLEAD)组(42例)和LEAD组(38例),选择本院同期30名健康体验者纳入NC组,检测各组MMP-9和TGF-β1水平。结果 NLEAD组MMP-9水平为(81.23±10.63)ng/mL,LEAD组为(129.34±21.48)ng/mL,高于NC组的(52.32±9.31)ng/mL,F=2 083.023,P<0.001,且LEAD组高于NLEAD组,t=15.642,P=0.001。NLEAD组TGF-β1水平为(19.98±4.11)ng/mL,LEAD组为(32.65±7.48)ng/mL,高于NC组的(12.26±3.05)ng/mL,F=579.110,P<0.001,且LEAD组高于NLEAD组,t=7.453,P=0.002。多因素Logistic回归分析结果显示,空腹血糖(OR=2.105,95%CI为1.554～2.853,P<0.001)、收缩压(OR=1.312,95%CI为1.108～1.563,P=0.001)、MMP-9(OR=2.145,95%CI为1.471～3.286,P<0.001)、TGF-β1(OR=2.675,95%CI为1.436～4.982,P=0.002)和吸烟史(OR=1.468,95%CI为0.455～0.663,P<0.001)是T2DM合并LEAD的独立危险因素,而高密度脂蛋白胆固醇(OR=0.549,95%CI为0.455～0.662,P<0.001)是保护因素。结论血清MMP-9和TGF-β1表达水平与T2DM的LEAD有关联,两者均升高,共同促进T2DM患者LEAD的发生发展。