山羊痘病毒属成员检测方法的研究进展

山羊痘病毒属(Capripoxvirus,CaPV)成员包括牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)、山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV),这三种病毒可跨界传播,已在全球大多数国家出现暴发或流行,严重影响了牛羊养殖业发展。由于CaPV成员的核苷酸相似性高达96%~97%,且不具有严格宿主特异性,一般检测方法很难鉴别CaPV成员,因此建立早期、快速、准确鉴别CaPV成员的方法将有助于阻止疫病传播。笔者综述了国内外CaPV成员检测方法的最新研究进展,包括病毒分离鉴定、病毒中和试验(virus neutralization test,VNT)、间接荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody test,IFAT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫过氧化物酶单层分析(immunoperoxidase monolayer analysis,IPMA)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)、环介导等温扩增试验(loop mediated isothermal amplification test,LAMP)、高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting curve analysis,HRM)和重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)等,并论述不同检测方法的优缺点,以期为进一步探索CaPV成员检测方法提供参考。

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒及鉴别类NADC30毒株的双重荧光定量PCR方法

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守区和类NADC30毒株的双重TaqMan探针荧光定量PCR方法,分别针对保守的N蛋白基因和Nsp2基因设计特异性引物和探针,通过优化反应体系及反应条件对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估。结果显示,双重标准曲线的相关系数(R^(2))均大于0.990,具有良好的线性关系;最低检测限分别为5.27 copies/μL和3.00 copies/μL,具有较高的灵敏度;不与其他常见猪病病原发生非特异反应,且重复性良好,批内批间变异系数均小于3%。对168份临床样本的检测结果显示,PRRSV总阳性检出率为68.45%(115/168),其中类NADC30检出率为32.14%,混合感染率为20.24%,与临床诊断结果相一致。结果表明,本方法可用于检测PRRSV和鉴别类NADC30毒株以及猪繁殖与呼吸系统综合征的流行病学调查。

猫细小病毒和猫疱疹病毒1型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测猫细小病毒(FPV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的双重荧光定量PCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重荧光定量PCR方法,并绘制了标准曲线,其相关系数(R2)均为0.999,具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87和2.21 copies/μL;对猫的常见病毒及细菌均无非特异反应;批内、批间试验的变异系数均小于2%。证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。用建立的方法对178份样本进行检测,结果,FPV和FHV-1的阳性检出率分别为73.65%和16.85%,二者混感阳性率为15.73%,与临床确诊结果一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。

猪流行性腹泻病毒通用实时荧光定量RT-PCR方法的建立与初步应用

以猪流行性腹泻病毒(PEDV)一段保守的M基因序列为靶标,建立可匹配96.93%现有毒株的PEDV实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化反应条件后绘制标准曲线,相关系数R2=0.9995,线性关系良好。该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪链球菌、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪丁型冠状病毒无交叉反应,特异性良好。灵敏度和重复性试验结果显示对PEDV的最低检测限为2.10 copies/μL,且批内、批间重复试验的变异系数均小于2%。用该方法与本病原行业标准方法对162份临床样本进行同批对比检测,结果与行业标准方法的阳性符合率为100%。结果表明,本方法特异性、灵敏度、重复性好,能够有效检测病毒GⅠ和GⅡ基因型,能对导致猪群腹泻的PEDV进行早期确诊。