脑出血后大鼠神经干细胞增殖及迁徙途径的实验研究

目的探讨脑出血后大鼠神经干细胞增殖变化及迁徙途径。方法将75只SD大鼠随机分为脑出血组、假手术组和正常组,脑出血组采用自体血注入法复制脑出血模型。各实验大鼠腹腔注射溴脱氧核苷尿嘧啶(Brd U)标记神经干细胞,运用免疫组化染色观察神经干细胞增殖及迁徙分布情况。结果脑出血组侧脑室下区室管膜上皮的Brd U阳性细胞数比假手术组和正常组显著增加(P<0.05),Brd U阳性细胞沿胼胝体迁徙,最后散在分布于出血灶及周边区。结论脑出血后神经干细胞可增殖并沿胼胝体向出血灶及周边区迁徙,参与出血性脑损伤神经功能的修复。

GDNF基因修饰的BMSCs对大鼠缺氧复氧神经细胞凋亡的实验研究

目的研究腺病毒介导的外源性胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因在大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）中的表达及其对缺氧复氧神经细胞凋亡的影响。方法将GDNF基因重组腺病毒感染大鼠BMSCs,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术检测外源性GDNF基因在BMSCs中的表达水平;将GDNF基因修饰的BMSCs与缺氧复氧神经元共培养,观察神经细胞的凋亡情况。结果 GDNF基因感染组在感染后3~12 d能稳定表达GDNF蛋白,空质粒载体感染组和未感染组基本上无GDNF蛋白的表达;与BMSCs共培养组相比,BMSCs/GDNF分泌的GDNF能显著降低缺氧复氧神经细胞的凋亡率（复氧12 h至5 d,P〈0.05）。结论腺病毒介导的基因感染技术能够有效地将GDNF基因转至BMSCs中,表达和分泌有生物学活性的GDNF蛋白,这为进一步研究GDNF基因修饰的BMSCs应用于中枢神经系统疾病的治疗研究奠定了基础。

GDNF基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血的实验研究

目的:观察转染胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的神经干细胞(Neuralstem cells,NSCs)移植在脑缺血大鼠脑组织的分布,探讨其神经保护作用。方法:体外培养新生大鼠NSCs,采用改良的线栓法制作脑缺血再灌注模型,3d后用脑立体定位仪分别经脑室移植生理盐水、NSCs和GDNF/NSCs。各组移植前及再灌注1～7周进行神经功能损伤程度评分(Neurological severity scores,NSS)。免疫组织化学方法观察移植后NSCs的存活及分布情况。结果:NSCs经GDNF基因转染后2d发绿色荧光,抗nestin免疫荧光检测呈阳性。GDNF/NSCs组与NSCs组NSS评分比较,在再灌注2周和3周显著降低(P<0.05)。移植的NSCs分布于缺血侧皮质、纹状体,移植后3、5、7周,阳性细胞数分别较1、2周显著增多(P<0.05)。GDNF/NSCs组与NSCs组比较,第2、3、5、7周纹状体、皮质阳性细胞数显著增多(P<0.05)。从病理学上观察,GDNF/NSCs组神经毡较NSCs移植组致密。结论:移植GDNF基因修饰的神经干细胞能改善脑缺血大鼠神经功能,对脑缺血所致的损伤具有一定修复作用。

运用新的体视学方法研究老年大鼠胼胝体有髓神经纤维中的分区方式

目的:基于新的体视学方法的基本要求,建立胼胝体有髓神经纤维定量研究的分区方法。方法:大鼠大脑连续组织切片后,基于改良Witelson分区的方法,定义胼胝体的分区。结果:研究发现老年大鼠胼胝体有髓神经纤维额区体积较年轻大鼠显著下降28.6%,有髓神经纤维总体积显著下降17.4%。结论:采用这一建立在新的体视学方法要求之上的胼胝体纤维分区方式,能准确地从微观上解释不同胼胝体区域内神经纤维的直径、数量等信息以及相关变化与功能变化之间的联系。

移植GDNF基因修饰的神经干细胞对大鼠脑卒中的神经保护作用

目的：探讨移植胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的神经干细胞（NSCs）是否比单纯NSCs移植对脑卒中有更好的神经保护。方法：用GDNF重组质粒转染NSCs，构建过表达GDNF的NSCs（GDNF／NSCs）。插线法制备大鼠脑缺血卒中模型，再灌注3d，脑立体定位分别移植NSCs、GDNF／NSCs以及生理盐水到同侧侧脑室，实验分为GDNF／NSCs组、NSCs组和对照组。再灌注第1、2、3、5和7周处死大鼠，用改良的神经功能缺失评分和H-E染色分别评估大鼠神经功能和脑梗死体积；免疫组织化学显色观察移植的NSCs数量与分布和突触蛋白Syn、PSD-95在脑组织的表达。结果：再灌注2、3周，GDNF／NSCs组较NSCs组神经功能恢复更好。在各时间点GDNF／NSCs和NSCs组大鼠脑缺血体积较对照组显著减小；GDNF／NSCs组的NSCs细胞数量较NSCs组显著增多。再灌注2和3周，GDNF／NSCs组Syn免疫阳性产物比NSCs组显著增加；各时间点GDNF／NSCs组的PSD-95免疫阳性产物比NSCs组显著增加。结论：GDNF基因修饰的NSCs比NSCs对大鼠脑卒中有更好的神经保护作用。

人参皂甙Rb1对大鼠脑缺血再灌注时神经元凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响

目的观察人参皂甙Rb1(Ginsenoside Rb1,GRb1)对大鼠脑缺血再灌注时神经细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响,探讨GRbl的神经保护作用机制。方法阻塞大鼠大脑中动脉2 h制备脑缺血再灌注模型,大鼠随机分为缺血再灌注组(I/R组)和GRbl给药组(GRb1组),GRb1组大鼠在再灌注后立即腹腔注射GRb1(40 mg/kg)。两组再按不同的再灌注时间(3 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和10 d,每时间点4只)分为7个亚组。分别用HE染色、TUNEL染色和免疫组化染色观察神经组织病理改变、细胞凋亡、Bcl-2和Bax的表达。结果与I/R组相比,GRb1能减轻缺血侧脑组织的病理改变,减少神经细胞凋亡数(12 h、1 d、2 d和3 d时P<0.05),上调Bcl-2阳性细胞数(12 h、1 d、3d、5 d和10 d时P<0.05)和降低Bax阳性细胞数(3 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和10 d时P<0.05)。结论GRbl对脑缺血再灌注损伤有保护作用,其机制与抑制神经元凋亡、促进Bcl-2表达和抑制Bax表达有关。

大鼠脑出血后神经行为学和脑组织病理学改变的特点

目的观察大鼠脑尾壳核出血后不同时间点神经行为学和脑组织病理学的特点,为利用该模型研究脑出血的治疗措施提供参考依据。方法将成年SD大鼠随机分为正常组、假手术组和脑出血组;脑出血组大鼠通过立体定向术向脑内注入自体动脉血制成脑尾壳核出血模型,并按不同的再喂养时间(1d、3d、7d、14d、30d)分为5个亚组。采用神经功能评分和HE染色分别观察脑出血大鼠神经行为学和脑组织形态学的改变。结果与正常组和假手术组相比,脑出血组大鼠的神经行为学评分上升(1d和3d时P<0.05,7d、14d和30d时P>0.05)。脑出血后1～3d在尾壳核区域可见椭圆形或不规则血肿;7d出血灶内部分血细胞被吸收,血肿周围脑组织有胶质细胞增生;14d时出血区形成一个椭圆形或不规则囊腔;30d时病灶区仅存少量血细胞,出血周边区见胶质细胞进一步增多。结论脑出血后神经行为学的改变、血细胞的吸收及囊腔的形成与出血时间有关,此结果为选择时间窗治疗脑出血疾病提供了参考资料。

胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定

构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果显示大鼠GDNFcDNA被成功克隆,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,以上结果说明本实验成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞移植抑制大鼠脑出血后神经细胞的凋亡

目的探讨移植胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠脑出血后神经细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响。方法通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,将48只模型大鼠随机分为BMSCs组、GDNF/BMSCs组和生理盐水组,各组又根据细胞移植后再喂养时间的不同(1周、2周)分为2个亚组,每亚组8只大鼠。于建模后第3天在脑出血部位分别移植BMSCs、GDNF/BMSCs或注射生理盐水,采用神经功能缺失评分和HE染色评估大鼠神经功能缺失情况和脑损伤面积,RT-PCR法观察GDNF mRNA的表达,原位缺口末端标记法(TUNEL)和免疫组织化学染色观察细胞凋亡数及Bax和Bcl-xl蛋白的表达。结果与生理盐水组和BMSCs组相比,GDNF/BMSCs组神经功能恢复更好,脑损伤面积所占比率显著降低,GDNF mRNA表达上调,凋亡细胞数明显下降。在1周和2周时间点,GDNF/BMSCs组与BMSCs组和生理盐水组相比,Bcl-xl阳性细胞数明显增加,而Bax阳性细胞数则减少。结论 GDNF基因修饰的BMSCs移植至脑出血大鼠后,可能通过上调GDNF基因的表达、抑制细胞凋亡、增加Bcl-xl蛋白的表达和降低Bax蛋白的表达发挥神经保护作用。

GDNF基因修饰的BMSCs在脑出血大鼠脑内存活与分化的实验研究

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在脑出血大鼠脑内的存活与分化。方法:分别将BMSCs/GDNF、BMSCs和生理盐水移植入脑出血大鼠脑内建立不同的实验组,采用Western blot检测各组大鼠GDNF蛋白的表达,DAPI和免疫荧光组织化学染色观察移植细胞在脑内的存活和分化情况。结果:与生理盐水组和BMSCs组相比,BMSCs/GDNF组的GDNF蛋白表达显著上调;与BMSCs组相比,BMSCs/GDNF组的BMSCs存活率增高,神经微丝阳性细胞率上升,但胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率无明显变化。结论:GDNF基因修饰有助于BMSCs在脑出血大鼠脑内的存活和向神经元样细胞方向分化。

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰骨髓基质干细胞移植脑出血大鼠神经营养因子的表达

背景:研究证实,细胞移植和神经营养因子相结合治疗脑损伤能促进大鼠神经功能的恢复。目的:观察移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞对大鼠脑出血后神经营养因子表达的影响。方法:通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,将48只模型鼠随机分为3组,骨髓基质干细胞组、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组和对照组于建模后第3天在脑出血部位分别移植骨髓基质干细胞、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞以及生理盐水。结果与结论:与对照组和骨髓基质干细胞组相比,胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组大鼠神经功能恢复更好;与对照组相比,移植后1,2周其他2组各神经营养因子表达均显著增加(P<0.05)。提示胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗脑出血大鼠比单纯骨髓基质干细胞有更好的神经保护作用。

缺血性脑血管病的研究进展

脑血管病是由脑部血液循环障碍，导致以局部神经功能缺失为特征的一组疾病。具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和并发症多的特点。在人类各种疾病死因的排序中，脑血管病一直列于前三位之内。正因为如此，脑血管病的防治工作已成为当今世界医学的重要课题。

胶质源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞与缺氧复氧神经细胞的共培养

背景:课题组前期研究表明,胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞能稳定地表达胶质源性神经营养因mRNA,但骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子分泌的胶质源性神经营养因子蛋白对缺氧复氧损伤的神经细胞是否积极影响,尚不清楚。目的:观察胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞对缺氧复氧神经细胞的保护作用。方法:胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞经诱导后与缺氧复氧神经细胞共培养,采用Hoechst33258细胞免疫荧光染色分别检测神经细胞凋亡及生长相关蛋白43在共培养细胞中的表达。结果与结论:骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子组的神经细胞凋亡率显著低于骨髓间充质干细胞组和缺氧组(P0.05),骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子组表达生长相关蛋白43的吸光度值明显高于骨髓间充质干细胞组(P0.05)。提示骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子通过抑制缺氧复氧神经细胞凋亡和促进共培养细胞生长相关蛋白4表达发挥神经保护作用。

新生大鼠神经干细胞培养过程中加入相关因子对其生长特性的影响

目的:观察神经干细胞体外分离、培养过程中加入人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子后生长情况及二次传代后加入多聚赖氨酸对其生长的影响。方法:实验于2004-09/2005-02在泸州医学院神经生物学研究室进行。①分离新生Wistar大鼠大脑组织,采用原代机械吹打使其成为细胞悬液后,离心,吸去上清液,加入干细胞培养液(10g/L牛血清白蛋白、人重组表皮生长因子20μg/L、人重组碱性成纤维细胞生长因子20μg/L、N2补充液)重悬细胞,因其是否接种在含或者不含多聚赖氨酸包被玻片的培养瓶内分为包被组和不包被组。②将上述培养的细胞悬液离心、消化后再加入干细胞培养液重悬细胞,以1×105个/mL密度接种在25mL培养瓶内。以后两三天换液一次,五六天传代一次。③取包被组二次传代后的神经球滴在包被有多聚赖氨酸的盖玻片上观察神经干细胞生长情况。结果:①细胞培养过程中加入人重组表皮生长因子和人重组碱性成纤维细胞生长因子后,细胞团数量逐渐增多,原来的小细胞团体积变大,分裂的细胞折光性更强,更透亮。随着培养时间延长,瓶内飘浮的细胞团数目更为增加,几乎都成规则细胞球。将培养细胞五六天传代一次。②在预先置入有多聚赖氨酸包被的玻片组,培养第2天,全部的单个细胞和细胞团贴壁、分化,以后分化细胞逐渐增多,突起交织成网,几乎贴满瓶底。但在培养的第4天,瓶底逐渐出现成团细胞簇,起初数量少,后数量增多,贴壁生长。培养第7天后,细胞簇陆续挣脱瓶底,漂浮在培养液中,成为游离细胞球。细胞球体积明显小于不加多聚赖氨酸处理的玻片组,即使增加培养时间,也未见细胞团继续长大。将二次传代后的神经球,继续加多聚赖氨酸处理的玻片,细胞生长状况同原代。结论:①在神经干细胞的分离及培养、传代过程中加入促有丝分裂因子人重组表皮生长因子和人重组碱性成纤维细胞生长因子能促进神经干细胞的分裂和增殖。②相同培养条件下,加入多聚赖氨酸包被的玻片,神经干细胞生长的速度和大小均小于不加入多聚赖氨酸包被的玻片。

Neuroplastin在培养的神经元的表达及对小脑颗粒细胞神经突起生长与神经元存活的影响

研究neuroplastin在培养神经元的表达及对大鼠原代培养小脑颗粒细胞分化与存活的影响。培养大鼠小脑颗粒细胞、中脑多巴胺能神经元、海马神经元、PC12-E2、新生鼠前脑组织,用RT-PCR检测neuroplastin65 mRNA和neuroplastin55 mRNA的表达;加入neuroplastin合成肽,观察小脑颗粒细胞神经突起生长及在低钾的神经毒性条件下神经元的存活。结果表明:在培养0、7d的海马神经元、中脑多巴胺能神经元、小脑颗粒细胞以及新生鼠前脑组织、PC12-E2细胞均表达np65 mRNA、np55 mRNA,且np55 mRNA的表达高于np65 mRNA;来自neuroplastin Ig1的合成肽是1ab-s,1cd-s,1dd,1ef,1fg;来自neuroplastinIg2的合成肽是2cd和2fg。1fg,1cd-s,2cd,2fg强烈刺激神经突起的生长,1dd,1ab-s中等程度刺激神经突起的生长,1ef,1bc则无效。1cd-s,1bc,1dd,1ef,2cd,2fg能促进低钾神经毒性环境下神经元的存活,1fg,1ab-s无效。以上结果提示,neuroplastin通过亲同性结合或亲异性结合后,诱导神经突起生长和促进神经元存活。

GDNF基因修饰的神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后GFAP表达的影响

目的探讨胶质源性神经营养因子（glial cell line-derived neural factor,GDNF）基因修饰的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植对大鼠脑缺血后（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的表达的影响。方法建立大鼠暂时性大脑中动脉梗塞模型（middle cerebral artery occlusion,MCAO）,再灌注3d,并将其随机分为：生理盐水移植组（NS）、神经干细胞移植组（NSCs）和GDNF基因修饰的神经干细胞移植组（GDNF/NSCs）。采用脑立体定位仪将移植入大鼠的右侧脑室。再灌注1、2、3、5、7周的各时间点,处死大鼠,取同侧大脑半球,用Western blotting观察GFAP的表达。结果 GDNF/NSCs组、NSCs组和NS组GFAP蛋白均在2周达到高峰,后逐渐降低。而再灌注1~7周,GDNF/NSCs组的GFAP蛋白显著高于NS组（P〈0.001）;GDNF/NSCs组GFAP蛋白显著高于NSCs组（P〈0.01）。再灌注1~5周,NSCs组GFAP蛋白显著高于NS组（P〈0.001）。结论 GDNF/NSCs移植治疗大鼠缺血再灌注的神经保护作用,其机制可能与促进GFAP的表达有关。

新生大鼠神经干细胞移植对脑缺血再灌注损伤的治疗作用

目的：探讨新生大鼠神经干细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的可行性及疗效。方法：体外培养新生大鼠神经干细胞。采用改良的线栓法制作脑缺血再灌注模型，3d后用脑立体定位仪经脑室移植神经干细胞，移植时间点及再灌注1～7周对移植大鼠进行神经功能损伤程度评分（NSS）。再灌注1、2、3、5、7周末麻醉处死大鼠，脑组织石蜡包埋。免疫组织化学方法观察移植后神经干细胞的存活、分布。结果：神经干细胞表达巢蛋白，在血清条件下分化为表达微管相关蛋白（MAP2）的神经元和表达胶质细胞纤维酸性蛋白（GFAP）的星形胶质细胞。神经干细胞移植组NSS评分在各个时间点均显著低于对照组。移植的神经干细胞分布于缺血侧皮质、纹状体，再灌注后3、5、7周，皮质、纹状体阳性细胞数分别较1、2周显著增多，第3、5、7周之间差异无统计学意义。前3周组织结构疏松，缺损严重，而第5、7周组织结构较前3周完整致密。结论：移植的神经干细胞能在脑缺血大鼠脑内存活、迁移，并能改善缺血后大鼠的神经功能状况。

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的:已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞,实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性,以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞,为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。方法:实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物:选择5只普通级SD大鼠,由泸州医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉,取双侧胫骨和股骨,磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔,采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,胰蛋白酶与EDTA联合消化,传至第4代,用含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估:观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。结果:①骨髓基质细胞形态观察:原代细胞接种1d后开始贴壁增殖,3d后多数贴壁,贴壁细胞呈梭形或扁平形;10d后90%细胞融合,以长梭形为主,突起粗大,形成网状、片状;传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强,7d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化:第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7d,成球的细胞脱离瓶底,悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清,换成血清分化液后,细胞球逐渐贴壁,球周围很快发出突起,分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达:骨髓源性细胞球表达巢蛋白,呈棕黄色,为神经干细胞;从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。结论:骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞,且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。

GDNF基因修饰的神经干细胞抑制脑卒中后大鼠的Caspase-3表达

目的研究胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neural factor,GDNF)基因修饰的神经干细胞(neuralstem cells,NSCs)移植对脑卒中后大鼠缺血侧脑组织内半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific protein-ase-3,caspase-3)表达的影响,探讨GDNF基因修饰的神经干细胞(GDNF/NSCs)移植对大鼠脑卒中的神经保护作用机制。方法取新生大鼠脑组织分离培养NSCs,收集第6代前的NSCs备用。用重组腺病毒GDNF转染神经干细胞,制备GDNF/NSCs。暂时性阻塞大鼠大脑中动脉制备脑卒中模型,3d后,用脑立体定位仪向卒中侧侧脑室分别给予NSCs、GDNF/NSCs和生理盐水。再灌注时间1周、2周、3周、5周、7周后处死大鼠(n=3)。裂解卒中侧脑组织,离心后得到脑组织蛋白样品,通过蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测Caspase-3表达。结果 GDNF/NSCs、NSCs、NS各组caspase-3的表达在1周、2周、3周、5周、7周各时间点均逐渐降低。NSCs组、GDNF/NSCs组显著低于NS组(P<0.01;P<0.001);GDNF/NSCs组明显低于NSCs组(P<0.01)。结论 GDNF/NSCs移植治疗脑卒中的机制可能与抑制caspase-3表达有关。