STAT1特异性siRNA真核表达载体的构建及体外转染优化

目的:构建STAT1特异性siRNA真核表达载体,并转染人气道上皮细胞(16HBE)。方法:根据GeneBank数据库提供的STAT1基因两种变异体的共同核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链siRNA,再转化为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)的DNA序列,并将其连接到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的pGenesil-1.1真核表达载体上,将其转染至气道上皮(16HBE)细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率。结果:通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建了二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到(16HBE)细胞株中,质粒/脂质体为1μg:2μl条件,能有效地转染细胞,转染效率达到50%以上。结论:成功构建siRNA真核表达载体并能成功体外转染,为下一步气道炎症性疾病的基因沉默研究奠定了良好的基础。

STAT6报告基因的构建与在成纤维细胞中表达

目的构建携带信号转导子与转录活化子6(STAT6)基因的真核表达载体,为进一步研究STAT6转录因子在肺纤维化中的作用与作用机制提供基础。方法:以含有STAT6的基因文库为模板通过PCR反应扩增出该基因的全序列cDNA,并克隆到增强型绿色荧光报告基因的真核表达质粒中,经酶切鉴定及测序分析对重组质粒pEGFP-STAT6作进一步鉴定。将重组质粒pEGFP-STAT6转染到成纤维细胞中。结果:STAT6基因能正确克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建成重组质粒pEGFP-STAT6。STAT6基因在成纤维细胞中表达。结论:成功构建pEGFP-stat6重组质粒,并在成纤维细胞中表达。