利用宏基因组测序分析一起食蟹猴致死因素

为分析死亡食蟹猴脑组织菌群结构情况,初步探索细菌对食蟹猴的致死因素,本研究按照标准化操作流程收集死亡食蟹猴的大脑、小脑病理组织样本,提取样本中全部细菌总DNA,利用通用引物27F/338R PCR扩增细菌16S rDNA V1-V2高变区。扩增产物经高通量测序,并利用QIIME软件对测序数据进行生物信息学分析。结果显示,测序共生成238 Mbp原始数据,获得脑组织细菌的结构组成,其中优势菌门包括厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门,优势菌科包括普雷沃氏菌科、瘤胃菌科、鞘氨醇单胞菌科等,含量最高的细菌属为普雷沃菌属、螺旋体属、交替假单胞菌属等。本研究结果表明死亡食蟹猴的脑组织中含有多种细菌,可能会引起感染和炎症,结合病理学检查,提示食蟹猴脑组织病原菌感染可能与死亡的发生存在一定关联。

危重新生儿遗传性疾病快速全基因组测序专家共识

危重症患儿是遗传性疾病(遗传病)的高发人群,遗传因素导致的脏器功能衰竭是危重症患儿死亡的重要原因之一[1⁃3]。遗传病的临床表现在疾病早期往往不典型,尤其在NICU的新生儿中可能尚未完全显现。危重症状态下的患儿遗传病表型还可能被其他临床症状所掩盖,给病因的诊断带来困难[4,5]。在明确诊断的过程中,这些患儿通常需要完成多种常规检测,重复采集血样,进行各种辅助检查,甚至实施侵入性操作,这不仅给患儿带来较多痛苦,也使家庭承受了很大的经济负担[6]。但即使是完成了上述各种检查,可能还是难以找到真正的致病原因。部分疾病的临床进展十分迅速,如果不能早期明确诊断,及时采取针对性的治疗措施,可能有致死、致残等严重后果。

单细胞测序技术研究进展及其法医学应用展望

单细胞测序是在单个细胞的水平上,利用新一代测序对DNA和RNA序列进行解析的技术。单细胞测序的超高精度给包括法医基因组在内的生命科学领域多种组学相关问题提供了新的解决思路,本文就当前该技术的研究进展和法医学应用展望进行综述。

宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)

基于宏基因组学测序(mNGS)的病原学诊断技术是一种非靶向的广谱病原学筛查技术,近几年越来越多的研究表明其在重症感染领域,特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了关键性作用。由于mNGS高昂的成本及较高的实验条件要求,目前尚未纳入常规临床检验中。可以预见,随着测序成本的下降及我国医疗水平的不断提高,基于mNGS的病原学诊断技术在临床大规模开展的条件已经逐步成熟。本文从检测、规则和应用等方面阐述了基于mNGS技术在临床中重症感染患者病原学诊断中应用的专家共识,并对其未来在临床应用改进方面提出了展望。

PCR扩增循环数对细菌群落多样性测序分析的影响

运用高通量测序技术分析复杂样品中微生物群落组成及变化趋势,已经成为目前微生物研究领域的热点之一。本研究以复杂土壤样品和应用范围较广的瘤胃食糜样品为对象,选取20、25和30三个扩增循环数分别对样品的16S r RNA基因的V3区进行扩增,然后进行文库构建和测序。最后通过数据分析比较不同的扩增循环数对细菌多样性测定结果的影响。结果表明,扩增循环数越多,捕获到的细菌数量和种类越多;但并非循环数越多,群落中的微生物组成比例最优。整体来看,当扩增循环数为25时,样品中物种的数量和组成是最优的。

DNA提取对微生物多样性测序分析的影响

运用高通量测序技术分析复杂样品中微生物种群的变化情况,已经成为目前微生物研究领域的热点问题之一。而微生物的样品准备,如DNA提取和16S可变区的扩增等,对于测序完成后的数据分析以及微生物原始群落组成的影响是至关重要的。采用国产试剂盒(天根土壤微生物基因组提取试剂盒)和进口试剂盒(MOBIO土壤微生物基因组提取试剂盒)分别对土壤样品和羊瘤胃食糜样品进行DNA提取。然后选取总DNA起始量为25ng,对16S V3可变区进行PCR扩增和文库构建,最后通过数据分析比较不同试剂盒提取的DNA对微生物多样性变化的影响,包括OTU数目、稀释曲线、微生物数量及物种种类等。研究发现,在相同DNA模板量和PCR条件下,进口试剂盒提取的DNA能够获得更多的微生物种类。

儿童急性B淋巴细胞白血病二代测序的基因组学及其对微小残留病的影响

目的描述初诊急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿基因突变谱并分析其对微小残留病(MRD)的影响。方法回顾性队列研究。选取2018年9月至2021年7月中国医学科学院血液病医院诊治的506例初诊B-ALL患儿为研究对象。入组患儿依据化疗开始第19天MRD结果分为MRD≥1.00%组和<1.00%组,依据第46天MRD结果分为MRD≥0.01%组和<0.01%组。分别比较不同组患儿临床特征及基因突变等的差异,组间比较采用χ^(2)检验或Fisher确切概率法。通过Logistic回归分析第19天和第46天MRD的独立影响因素。结果506患儿中男318例、女188例。第19天MRD≥1.00%组患儿114例、MRD<1.00%组患儿392例;第46天MRD≥0.01%组患儿76例、MRD<0.01%组患儿430例。506例患儿中487例(96.2%)患儿检测到共187种基因突变,其中信号转导相关KRAS基因(111例,占22.8%)、NRAS基因(99例,占20.3%)是常见的突变基因。多因素分析示PTPN11(OR=1.92,95%CI 1.00~3.63)、KMT2A(OR=3.51,95%CI 1.07~11.50)基因突变和TEL-AML1(OR=0.48,95%CI 0.27~0.87)、BCR-ABL1(OR=0.27,95%CI 0.08~0.92)融合基因及发病年龄>10岁(OR=1.91,95%CI 1.12~3.24)均为第19天MRD≥1.00%的独立影响因素。BCORL1(OR=2.96,95%CI 1.18~7.44)、JAK2(OR=2.99,95%CI 1.07~8.42)和JAK3(OR=4.83,95%CI 1.50~15.60)基因突变及TEL-AML1融合基因(OR=0.43,95%CI 0.21~0.87)均是第46天MRD≥0.01%的独立影响因素。结论儿童B-ALL易发生基因突变,以RAS信号通路异常最常见。信号转导相关PTPN11、JAK2、JAK3基因突变,表观遗传相关KMT2A基因突变,转录因子相关BCORL1基因突变是MRD的独立危险因素。

基于高通量测序的2型糖尿病易感基因靶向测序panel设计及临床应用

目的利用高通量测序(NGS)和多重PCR技术设计基于扩增子的靶向测序panel,对T2DM易感基因进行测序,并评估其与T2DM患者临床特征的关系。方法通过Illumina测序平台,设计多重PCR扩增的靶向测序panel,对16个T2DM易感基因21个SNP位点进行测序。收集1043份确诊T2DM患者的外周血DNA样本进行检测。结果 PCR扩增子在不同样本之间的测序深度具有良好的可重复性,且不同扩增子测序数据分布具有高度一致性,除rs864745和rs712523外,测序深度达到1000×以上。18个SNP位点差异均有统计学意义(P<0. 05)。结论通过NGS技术,利用基于扩增子的靶向测序panel进行T2DM易感基因检测的可行性和实用性,验证了KCNQ1、CDKAL1、CDKN2B是T2DM发病的风险基因。

基于下一代测序技术的BRCA1/2基因检测指南(2019版)

BRCA1/2基因检测有着重要的临床意义,有助于评估乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等相关肿瘤的发病风险,并可以协助制定患者的精准诊疗方案。为建立基于下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术的BRCA1/2基因检测的方法学标准,编写组在2018年《基于NGS技术的BRCA基因检测流程中国专家共识》的基础上,组织国内分子病理及临床专家,补充相关领域更新,并结合国内检测现状,形成《基于NGS技术的BRCA1/2基因检测指南(2019版)》,对BRCA1/2基因检测的适用人群及检测流程进行了梳理,旨在进一步指导和规范BRCA1/2基因检测的临床应用,优化患者的个体化诊疗实践。

基于16S rRNA基因测序法分析北京霾污染过程中PM_(2.5)和PM_(10)细菌群落特征

2013年1月8~14日,北京出现了严重的霾污染.霾污染时高浓度的大气颗粒物增加了暴露人群的健康风险,而大气中的微生物也可能带来一些风险,但目前对霾污染时大气中微生物组成了解较少.本研究选取了2013年1月8~14日北京7d的PM2.5和PM10采样样本,通过对细菌16S rRNA基因V3区扩增和Mi Seq测序,得到PM2.5和PM10中的细菌群落结构特征,并将结果与相同采样样本的宏基因组测序结果及三项国外基于16S rRNA基因测序方法的大气中细菌研究结果进行了比较.研究发现7 d连续采样条件下,PM2.5中细菌群落结构在门和属的水平上均差别不大.在属级别上,节杆菌属(Arthrobacter)和弗兰克氏菌属(Frankia)是北京冬季大气中细菌群落的主要类群.16S rRNA基因测序与宏基因组测序结果对比分析发现,在属级别上,两种分析方法中有39个相同的属类群(两种分析方法丰度前50的细菌类群合并所得),弗兰克氏菌属(Frankia)和副球菌属(Paracoccus)在16S rRNA基因测序分析结果中相对含量较多,而考克氏菌属(Kocuria)和地嗜皮菌属(Geodermatophilus)在宏基因组测序结果中相对含量较高.在门和属的水平上,PM2.5和PM10中细菌群落结构特征呈现出相似的规律.在门水平上,放线菌门(Actinobacteria)在PM2.5中的相对百分比较大,而厚壁菌门(Firmicutes)在PM10中的相对百分比较大.在属水平上,梭菌属(Clostridium)在PM10中的相对百分比较大.与三项国外基于16S rRNA基因测序研究结果对比发现,尽管在采样地点和采样时间上有较大差异,大气中普遍存在一些相同的细菌类群,且近地面大气细菌群落结构特征相似度较高,区别于高空对流层中细菌群落结构特征.

高通量测序方法在重症肺炎病原体检测的应用

目的 建立高通量测序技术检测重症肺炎病原体的流程和方法,并评估其可行性.方法 临床对照研究. 收集2015年3月至2016年12月深圳儿童医院就诊的76例重症肺炎的患者（实验组）和18例气管软化并排除细菌感染的患者（对照组）,采集肺泡灌洗液标本,同时进行临床检测和高通量测序,并对高通量测序的结果采用PCR方法进行确认,然后对基于高通量测序的重症肺炎病原体检测方法进行评估.采用χ2检验对高通量测序组和非高通量测序组的检出率进行相关性分析.结果 建立了基于高通量测序的重症肺炎病原体的检测流程及方法,该流程包括：标本收集、DNA提取、文库构建、上机测序及生物信息学分析.在76例重症肺炎患者中,66例患者的肺泡灌洗液标本的高通量测序结果为阳性,灵敏度86.84%,显著高于传统临床检验所用的细菌培养、免疫荧光法和定量PCR 3种方法综合检测的灵敏度（68.42%,52/76,χ^2=7.426,P〈0.001）.66份高通量测序阳性标本中,共检测到13种病原体,其中主要的病原体包括肺炎支原体、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和腺病毒等,非高通量测序法共检测到9种病原体.比较临床检验和高通量测序结果,在76份实验组标本中,发现61份（80.26%）标本两者结果完全一致,15份（19.74%）标本结果不完全一致,这些不一致检出的标本主要集中在高通量测序检测出腺病毒、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌而临床培养和免疫荧光方法不能检出这些病原体.PCR验证结果显示高通量检测结果与PCR的检测结果差异没有统计学意义（χ^2=0.517,P=0.472）,高通量检测结果与培养及免疫荧光方法检测结果差异有统计学意义（χ^2=11.671,P＆lt;0.001）.结论 基于高通量测序的重症肺炎病原体的检测方法灵敏度高,能检测出未知病原体,优于传统临床检验所用方法.

临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识

近年二代基因测序（ next-generation sequencing, NGS）技术快速发展,其应用已进展至临床检测,如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等. 国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用. 中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会前期组织病理、临床、生物信息等专家进行了充分讨论,拟在NGS的操作流程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议,以规范NGS在分子病理领域的应用.

基于下一代测序技术的BRCA基因检测流程中国专家共识

乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）是重要的抑癌基因，包括BRCA1和BRCA2。BRCA1／2基因是评估乳腺癌、卵巢癌和其他相关癌症发病风险的重要生物标志物，也是影响患者个体化治疗方案选择的生物标志物，所以BRCA检测具有重要的临床意义。

宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)

基于宏基因组学测序(mNGS)的病原学诊断技术是一种非靶向的广谱病原学筛查技术,近几年越来越多的研究表明其在重症感染领域,特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了关键性作用。由于mNGS高昂的成本及较高的实验条件要求,目前尚未纳入常规临床检验中。可以预见,随着测序成本的下降及我国医疗水平的不断提高,基于mNGS的病原学诊断技术在临床大规模开展的条件已经逐步成熟。本文从检测、规则和应用等方面阐述了基于mNGS技术在临床中重症感染患者病原学诊断中应用的专家共识,并对其未来在临床应用改进方面提出了展望。

基于Ti_(3)C_(2)T_(x)/聚酰亚胺复合材料的分散固相萃取-液相色谱法测定尿液中儿茶酚胺类神经递质

研究通过一种快速、简便的方法制备了聚酰亚胺功能化的二维碳化钛复合材料Ti_(3)C_(2)T_(x),并用作分散固相萃取吸附剂,结合液相色谱-荧光分析方法对尿液样品中痕量儿茶酚胺类神经递质(CAs)进行分离和分析。利用多种手段对Ti_(3)C_(2)T_(x)/聚酰亚胺的形貌、性质等进行了表征,并详细考察了萃取参数对Ti_(3)C_(2)T_(x)/聚酰亚胺萃取儿茶酚胺类神经递质的萃取性能的影响,结果表明,该复合材料可以通过静电、π-π和氢键作用有效富集目标化合物。最佳萃取条件如下:吸附剂用量为20 mg、样品pH为8.0、吸附时间和脱附时间分别为10 min和15 min、解吸溶剂为醋酸-乙腈-水(5∶47.5∶47.5,v/v/v)。将Ti_(3)C_(2)T_(x)/聚酰亚胺用作分散固相萃取吸附剂与HPLC-FLD联用,建立了一种尿液中CAs的灵敏检测方法,实现了4种CAs物质的定量分析。在最优的条件下,该方法中去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺和异丙肾上腺素的线性范围为1~250 ng/mL,相关系数(r^(2))均大于0.99,检出限LOD(S/N=3)在0.20~0.32 ng/mL之间,定量限LOQ(S/N=10)在0.7~1.0 ng/mL之间,日内精密度相对标准偏差(RSD)在0.7%~1.09%之间,日间精密度相对标准偏差(RSD)在1.73%~4.24%之间,在实际样品中的加标回收率在82.50%~96.85%之间,精密度RSD的范围在2.47%~9.96%之间。基于Ti_(3)C_(2)T_(x)/聚酰亚胺的分散固相萃取-液相色谱法具有萃取速度快、灵敏度高等特点,可以成功用于尿液中CAs的检测分析。

单细胞多组学技术和应用

单细胞多组学技术是指结合多种不同的生物学技术,对单个细胞进行多方面的分析和研究,从而获得更全面、更准确的单细胞数据。该技术包括单细胞基因组学、单细胞转录组学、单细胞蛋白质组学、单细胞表观组学等。单细胞多组学技术的发展为我们提供了一种更加精确理解生物体内复杂的细胞类型和功能的方式,尤其是对于异质性细胞群体中少数的特殊细胞类型如干细胞或罕见癌细胞,具有非常重要的应用价值。通过融合不同技术获得的信息,单细胞多组学可以更准确地描述单个细胞在多个生命事件和过程中的状态与变化,为生命科学的研究提供更加全面和深入的视角。本文系统概述了目前代表性单细胞多组学技术的发展现状,总结了其在生物学研究中的重要应用和巨大潜力。

乳胶免疫层析法定量检测猪尿液中的盐酸克伦特罗

目的:建立以彩色乳胶微球为标记物的免疫层析技术检测猪尿液中的盐酸克伦特罗(clenbuterol,CLB)。方法:彩色乳胶微球标记CLB抗体并真空冷冻干燥,盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白(CLB-bovine serum albumin,CLB-BSA)人工抗原与羊抗鼠抗体分别喷到硝酸纤维素膜上作检测线和质控线,猪尿液样本与冻干微球混匀后,插入试纸条,通过读条仪进行测定。结果:通过理化参数的优化,吐温-20为最优表面活性剂,选用300 nm乳胶微球,层析时间为9 min。方法的检出限为0.013 ng/m L,回收率范围在97.8%~106.0%之间,相对标准偏差不高于9.6%。结论:本研究成功建立了一种灵敏、准确的检测猪尿液中CLB的彩色乳胶免疫层析方法。

磁性酶联免疫吸附法检测玉米中黄曲霉毒素B_1

本研究将磁微粒替代酶标板作为固定相,用于酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测玉米中的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）。我们进行了两类比较：第一类是以单克隆抗体为基础的间接竞争法,2.8μm磁微粒的引入,使检测限较常规方法低近5倍,为0.028 ng/m L;第二类是以单克隆抗体为基础的直接竞争法,分别利用200 nm、2.8μm粒径的羧基磁微粒与抗体偶联,经测定,2.8μm磁微粒较常规ELISA法检测限低4.3倍,为0.012 ng/m L。玉米样品中AFB1回收率范围在84.2%~125.9%之间,相对标准偏差小于12.3%。

基于免疫磁分离-双重荧光定量PCR的鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测

目的使用免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法实现对鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的同时、快速检测。方法在37℃的条件下,利用特异性免疫磁球从250 m L循环体系中快速、有效地捕获目标菌。再通过特异性的引物与探针,对沙门氏菌和志贺氏菌进行双重荧光定量PCR检测。结果本研究方法针对鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测限分别达到3.4 cfu/g和9.4 cfu/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度均达到100%。此外,通过对30组实际样品的检测,该方法与传统标准方法的结果保持一致。结论本研究建立的免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法比国标方法更快速和高效,适用于鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测。