海洋创伤弧菌LAMP快速诊断方法的建立与评价

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立海洋创伤弧菌快速、简便、特异且敏感的检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。方法选取海洋创伤弧菌溶细胞素(vvhA)基因作为靶基因,根据GenBank公布的序列设计4条LAMP引物;对47株细菌(包括20株弧菌属细菌)进行LAMP和聚合酶链式反应(PCR)扩增,并做特异性比较;对创伤弧菌M06株增菌液10倍倍比稀释,提取DNA后进行灵敏度的检测,并与常规PCR作比较;构建含vvhA基因片段的重组质粒,作为LAMP反应体系的标准阳性对照。结果常规PCR实验出现假阳性结果,而LAMP实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增,其他样品均为阴性,无假阳性和假阴性结果,表明引物的特异性较好,加入钙黄绿素和电泳结果相一致;针对vvhA基因建立的LAMP技术其最低检测下限为每个反应4×10CFU,是常规PCR(每个反应4×10~2 CFU)的10倍,呈现较好的灵敏度。重复实验过程两遍,PCR和LAMP技术检测结果稳定。结论建立了一种用于检测海洋创伤弧菌的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,特别适合用于现场和床旁的快速检测。