铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coliBL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。

肺癌患者铜绿假单胞菌感染快速检测方法的应用

探讨胶体金免疫层析方法在感染铜绿假单胞菌肺癌患者快速床边检验的应用价值。方法:用分子生物学方法克隆OprF基因,原核系统诱导表达并纯化OprF,免疫BALB/c小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb。采用双抗体夹心法,建立了检测铜绿假单胞菌的胶体金免疫层析法,并对该方法的特异性、灵敏度和稳定性进行了评价,对121例晚期肺癌患者临床标本进行了检测。结果:成功克隆OprF基因,经原核诱导表达获得铜绿假单胞菌的OprF。通过杂交瘤技术筛选,经鉴定单克隆抗体3C3B5可作为捕获抗体,多克隆抗体被HRP标记后可作为检测抗体。以传统细菌培养和鉴定方法为参照,用胶体金免疫层析试纸条检测的敏感度为83.3%(45/54),特异性为92.5%(62/67),总符合率为88.4%。结论:成功制备了铜绿假单胞菌胶体金免疫层析法试纸条,实现了晚期肺癌感染患者床边检验和病情检测。中华肿瘤防治杂志,2012,19(2)