重组BCG的抑瘤活性及免疫学机制研究

目的:对重组GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因的BCG(卡介苗)进行抑瘤活性及免疫学机制研究。方法:建立EB病毒阳性肿瘤动物模型,对小鼠成瘤时间、存活情况、肿瘤重量进行分析,检测重组BCG的抑瘤活性;用ELISA方法对重组BCG刺激机体产生的特异性抗体进行检测,乳酸脱氢酶法检测特异性CTL杀伤效应,ELISPOT法检测IFN-γ的分泌水平,流式细胞术、HE染色检测重组BCG免疫小鼠的肿瘤组织中的淋巴细胞浸润情况。用统计学方法对重组BCG免疫效果进行初步分析和评价。结果:肿瘤成瘤时间与其他对照相比明显延迟,肿瘤生长明显缓慢,小鼠生存期延长。ELISA检测结果表明,重组BCG免疫后能产生针对GM-CSF和LMP2A的特异性Ig G抗体,重组BCG免疫组的小鼠能检测到特异性CTL活性,用ELISPOT法检测到免疫小鼠淋巴细胞有IFN-γ分泌;流式细胞术及形态学观察的方法检测到重组BCG免疫的小鼠肿瘤组织中有淋巴细胞的浸润生长。结论:重组BCG诱导C57BL/6小鼠机体产生了体液免疫和细胞免疫反应,重组BCG对EB病毒阳性肿瘤细胞具有明显抑制作用。

EB病毒融合基因Z2A重组BCG的免疫学特性研究

目的对EB病毒融合基因Z2A构建的重组BCG进行鉴定及免疫学研究。方法采用Western blot方法检测重组BCG中Z2A基因的表达;用重组BCG免疫小鼠,用ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体水平,采用乳酸脱氢酶法检测小鼠的细胞免疫水平,评价重组BCG的免疫效果。结果重组BCG表达的蛋白能被血清BZLF1抗体(或LMP2A抗体)识别;ELISA检测表明,重组BCG能刺激机体产生抗体,当重组BCG细菌数为5×108个/只时,抗体滴度最高为17 600(186.5±6.7pg/ml);BCG对照组及PBS对照组对GT39细胞的杀伤率分别为(32.5±2.7)%和(22.8±2.3)%,重组BCG组为(62.7±6.2)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EB病毒融合基因Z2A重组BCG免疫效果良好,能刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应。

GM-SCF与LMP2A融合基因GC2A重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒基因LMP2A融合基因GC2A的重组腺病毒表达载体。方法:将构建的融合基因GC2A定向亚克隆至质粒pAdTrack-CMV上,经酶切及电泳检测后,PmeL酶切pAdTrack-CMV-GC2A,与质粒pAdEasy-1一起电转化E.coli.BJ5183,筛选重组菌,经PacⅠ酶切鉴定后用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组腺病毒vAd-GC2A,采用pAdTrack-CMV-GC2A中报告基因GFP的表达,观测其表达情况。结果:采用内切酶Bg1Ⅱ和EcoRⅤ对质粒pAdTrack-CMV-GC2A进行双酶切分析,电泳后可观察到约1 961和9 200bp的片段。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切后观察到约33kb的DNA片段和4.5kb的DNA片段,说明pAdTrack-CMV-GC2A和pAdEasy-1的重组发生在ori和右臂区,pAd-GC2A经PacⅠ酶切线性化后,磷酸钙法转染293细胞,56h后在荧光倒置显微镜下可看到有绿色荧光出现,说明已转染成功,并能在293细胞中表达。结论:融合基因GC2A正确插入,真核表达载体vAd-GC2A成功构建,在293细胞中包装获得重组腺病毒。

人GM-CSF与EB病毒LMP2A融合基因的构建与鉴定

目的构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因LMP2A融合基因的原核表达载体。方法用随机引物Oligo(dT)15进行RT-PCR,分别获得人GM-CSF和LMP2A编码序列的cDNA。将纯化GM-CSF和EB病毒LMP2APCR扩增产物插入高效克隆载体pMD18-T,并转化入感受态细胞Esche-richia coli DH10B,在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基平板上进行蓝白斑选择,测序正确的序列进行剪接式重叠延伸,将目的基因GM-CSF和LMP2A编码经多肽接头(Gly4Ser)3序列连接,构建融合基因GC2A,将GC2A克隆至pMD18-T,转化感受态细胞E.coliDH10B,在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基平板上进行蓝白斑选择。结果目的基因GM-CSF和LMP2ART-PCR产物大小分别为470bp和1 545bp,与预期值一致。构建的重组质粒经双酶切、扩增及测序鉴定证实,融合基因(1 961bp)正确插入载体。结论融合基因正确插入pMD18-T,并成功转化入感受态细胞E.coli DH10B,为进一步研究奠定了基础。

GCA融合基因重组BCG穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建分泌性表达EB病毒GM—CSF与LMP2A融合基因GCA的卡介苗重组质粒。方法分别以卡介苗（BCG）和融合基因GCA的eDNA为模板，通过PCR扩增得到139bp的BCG-Ag85B信号肽序列和1961bp的GCA基因序列。将BCG—Ag85B信号肽序列与大肠埃希菌-卡介苗穿梭表达载体pMV261重组，得到重组质粒pMVS，再将融合基因GCA序列亚克隆至pMVS中，得到重组质粒pMV261-GCA。结果质粒pMV261-GCA经双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG-Ag85B信号肽和GCA正确插入载体pMV261。结论重组质粒可望在BCG中分泌性表达，该质粒的构建为改造BCG、发展新型抗EB病毒相关肿瘤疫苗奠定了基础。