应用No-touch技术分离静脉构建维持性血液透析患者自体动静脉内瘘

研究发现,在维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者自体动静脉内瘘(autogenous arteriovenous fistula,AVF)的构建过程中,静脉分离所造成的血管损伤可以通过激活血管外膜成纤维细胞、启动血管外膜炎症反应及损伤静脉滋养血管等导致AVF静脉血管内膜增生与血管狭窄等病变,进而引起AVF功能障碍。Souza等在利用大隐静脉进行冠状动脉旁路手术时,提出了静脉分离的No-touch技术,比较静脉分离的常规技术,其能够减轻静脉分离过程所造成的血管损伤,并提高术后移植静脉的通畅率。近年来,静脉分离的No-touch技术亦开始应用于MHD患者AVF构建过程中的静脉分离,为提高AVF术后通畅率提供了新的手术方法。本文将就应用该技术分离静脉构建AVF能够提高AVF术后通畅率的机制作一综述。

应用No-touch技术分离静脉减轻动静脉内瘘手术后早期近吻合口静脉缺氧及内膜增生的机制及研究进展

自体动静脉内瘘(autologous arteriovenous fistula,AVF)构建过程中近吻合口静脉分离所造成的滋养血管(vasa vasorum,VV)损伤及AVF手术后的血流动力学改变均可导致手术后早期近吻合口静脉缺氧,激活低氧诱导因子(hypoxia inducible factors,HIFs)以调节其下游信号通路促进血管壁的细胞增殖和胶原沉积,导致近吻合口静脉内膜增生(intimal hyperplasia,IH)与狭窄。冠状动脉旁路手术时,用于大隐静脉分离的No-touch技术(no-touch technique,NTT)能够减轻静脉分离过程中所造成的静脉VV损伤,且保留的静脉周围组织具有外支撑作用,能够减轻手术后移植静脉的血流动力学改变,从而减轻近移植静脉的缺氧及IH。近年来,该技术亦开始应用于AVF构建过程中的静脉分离,并取得了良好的临床效果。本文将对应用该技术分离静脉构建AVF减轻手术后近吻合口静脉缺氧及IH的机制及研究进展进行综述。

应用No-touch技术分离静脉构建家兔动静脉内瘘对手术后早期近吻合口静脉炎症反应及内膜增生的影响

目的 探讨应用No-touch技术(no-touch technique,NTT)分离静脉构建家兔颈总动静脉内瘘(arteriovenous fistula,AVF)对手术后早期近吻合口静脉炎症反应及内膜增生的影响。方法 24只雄性家兔随机分为常规技术(conventional technique,CT)组和NTT组分别构建家兔颈总AVF,每组12只。手术后第7天每组各随机取6只家兔AVF近吻合口静脉,定量逆转录聚合酶链式反应检测其Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)mRNA表达;手术后第21天每组各取剩余6只家兔AVF近吻合口静脉,苏木精-伊红染色测量其血管内膜厚度、内中膜厚度比值,免疫组化法检测其内膜增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。结果 CT组AVF近吻合口静脉内膜厚度、内中膜厚度比值较NTT组均明显增加(t=2.726、3.145,P=0.021、0.010);CT组AVF近吻合口静脉内膜细胞PCNA的阳性表达率明显高于NTT组(t=4.242,P=0.002),CT组AVF近吻合口静脉TLR4、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA的相对表达量均明显高于NTT组(t=13.457、12.116、9.693、9.678,均P<0.001)。结论 比较常规技术,应用No-touch技术分离静脉构建家兔颈总AVF能够减轻手术后早期近吻合口静脉炎症反应及内膜增生。

小肠黏膜下层促血管内皮细胞体外增殖及成血管化作用

目的探讨体外共培养条件下小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)对脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells,UVECs)增殖及成血管化功能的影响。方法采用胶原酶消化法原代培养获取UVECs并进行细胞形态学及免疫荧光鉴定。组织工程学方法制备SIS,免疫组化及酶联免疫吸附(ELISA)法检测SIS中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)等。建立UVECs与SIS体外共培养体系,设UVECs单独培养为对照组,比较两组UVECs的增殖状况及成血管化作用。结果通过原代培养成功获得UVECs。免疫组化检测制备的SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等细胞外基质成分组成;ELISA检测SIS孵育液中VEGF、b-FGF质量浓度分别为(48.83±5.67)、(72.36±8.71)ng/mL。体外共培养时,UVECs单独培养组无血管样结构形成,UVECs和SIS共培养组较UVECs单独培养组UVECs生长相对致密,且有血管样结构形成;UVECs生长曲线于UVECs和SIS共培养组上移,在对数生长期的第4、5天,UVECs和SIS共培养组UVECs细胞数分别为(7.91±0.42)×10~4、(9.15±0.48)×10~4,大于UVECs单独培养组的(4.26±0.27)×10~4、(6.71±0.31)×10~4(P<0.01),计算UVECs和SIS共培养组UVECs群体倍增时间短于UVECs单独培养组(P<0.01)。结论 SIS和UVECs体外共培养时,SIS可通过其Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等细胞外基质成分及所含的血管内皮细胞各生长因子等促进UVECs增殖及成血管化。

应用No-touch静脉分离技术构建前臂桡动脉-头静脉血管内瘘的临床效果

目的观察应用No-touch静脉分离技术分离头静脉构建前臂桡动脉-头静脉血管内瘘的临床效果。方法随机选择济宁医学院附属日照市人民医院自2011年7月~2015年6月构建的前臂桡动脉-头静脉血管内瘘118例,其中采用常规静脉分离技术分离头静脉的76例,采用No-touch静脉分离技术分离头静脉的42例。回顾性分析2组患者血管内瘘术后24月观察期内血管内瘘的并发症、功能障碍率及内瘘通畅率状况。结果 2组患者在年龄构成(χ~2=0.612,P=0.736)、性别构成(χ~2=0.000,P=0.995)、原发病构成(χ~2=0.352,P=0.999)、再次/初次手术比例(χ~2=0.015,P=0.901)、头静脉远端直径(<2mm/>2mm)比例(χ~2=0.001,P=0.978)、合并的血栓性疾病及血栓相关性危险因素(χ~2=0.829,P=0.991)、应用抗血小板药物(χ~2=0.069,P=0.793)及应用抗凝药物(χ~2=0.253,P=0.615)等方面,差异均无统计学意义。观察期内,在内瘘血管狭窄(χ~2=4.267,P=0.039)、假性动脉瘤(χ~2=4.129,P=0.042)、血栓形成(χ~2=3.895,P=0.048)等并发症发生率及血管内瘘功能障碍率(χ~2=3.944,P=0.047)方面,No-touch技术静脉分离组均少于常规技术静脉分离组;No-touch技术静脉分离组血管内瘘通畅率经log-rank检验高于常规技术静脉分离组(χ~2=4.785,P=0.029)。结论应用No-touch技术分离静脉构建前臂桡动脉-头静脉血管内瘘能够减少血管内瘘并发症发生率,延长血管内瘘使用时间。

α-氰基丙烯酸酯血管外支架对兔动静脉内瘘近吻合口静脉内膜增生的影响

目的观察α-氰基丙烯酸酯(α-cyanoacrylate,α-CA)血管外支架对兔动静脉内瘘(arteriovenous fistula,AVF)近吻合口静脉内膜增生的影响。方法取20只成年雄性家兔,随机分为2组,每组10只。①对照组:颈总动脉、颈总静脉端端吻合建立AVF。②α-CA组:AVF建立后,近吻合口静脉外周表面应用α-CA涂层建立血管外支架。分别于手术中、手术后1月,彩色多普勒超声检测近吻合口静脉的内径及收缩期峰值血流速度,并于手术后1个月取AVF近吻合口静脉作如下检测:HE染色测量其内膜厚度、内中膜厚度比值,免疫组化法检测其内膜增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。结果AVF手术后1个月,彩色多普勒超声检测显示对照组AVF近吻合口静脉内径[(3.50±0.30)mm]较α-CA组[(3.22±0.23)mm]明显增加(t=2.326,P=0.032);对照组AVF近吻合口静脉收缩期峰值血流速度[(512.0±83.6)mm/s]较α-CA组[(668.6±64.1)mm/s]明显降低(t=4,701,P<0.001)。HE染色显示对照组AVF近吻合口静脉内膜厚度[(35.3±6.1)]μm较α-CA组[(24.8±5.6)μm]明显增加(t=3.987,P=0.001);免疫组化法显示对照组AVF近吻合口静脉内膜PCNA、α-SMA的阳性率[(20.5±3.9)%、(25.9±4.7)%]明显高于α-CA组[(14.2±3.1)%、(16.5±3.7)%],组间比较,差异均有统计学意义(t值分别为3.993、4.948,P值分别为0.001、<0.001)。结论α-氰基丙烯酸酯血管外支架能够减轻家兔颈总动静脉内瘘近吻合口静脉内膜增生。

联合移植的脂肪间充质干细胞对胰岛移植物功能及生存的影响

目的探讨联合移植的脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,AMSCs)对胰岛移植物功能及生存的影响.方法分离纯化人的AMSCs和胰岛,移植于雄性Balb/c糖尿病裸鼠背部皮下,设联合AMSCs胰岛移植组、单纯胰岛移植组、PBS对照组及正常对照组4组.免疫组化双染观察胰岛细胞活性、凋亡状况及胰岛移植物血管化程度,并比较各组糖尿病裸鼠血糖、胰岛素水平及胰岛移植物存活时间.结果多元分析糖尿病裸鼠血糖、血清胰岛素水平,联合AMSCs胰岛移植组优于单纯胰岛移植组(P<0.01);联合AMSCs胰岛移植组胰岛移植物于移植术后平均存活时间(mean survival time,MST)为(81.33±7.58)d,经Log-rank检验长于单纯胰岛移植组的(58.17±6.91)d(P<0.05).胰岛移植后第7天,免疫组化双染,联合AMSCs胰岛移植组胰岛移植物的胰岛素染色强度高于单纯胰岛移植组,自杀相关因子(factor associated suicide,Fas)的表达密度则低于单纯胰岛移植组;血管计数显示联合AMSCs胰岛移植组胰岛移植物及周围微血管密度(microvascu-lar density,M VD)为21.8±5.6,显著高于单纯胰岛移植组的14.6±4.1(P<0.05).结论联合移植的AMSCs具有改善胰岛移植物功能、延长移植物存活时间及促进移植物血管再生的作用.

转染血管内皮生长因子165基因对胰岛移植物血管再生及移植效果的影响

目的 探讨转染血管内皮生长因子165（VEGF165）基因对胰岛移植物血管再生及移植效果的影响.方法 将含有VEGF165基因的慢病毒-VEGF165 （LV-VEGF165）体外转染大鼠胰岛细胞,移植于近交系SD雄性糖尿病大鼠肾包膜下,设未含有VEGF165基因的LV-AcGFP1为空载体对照组（LV-AcGFP1组）和单独胰岛细胞为空白对照组.ELISA检测VEGF165的体内外表达,胰岛素、CD31免疫组化双染观察胰岛移植物血管化程度及胰岛细胞活性,并比较各组糖尿病大鼠血糖、胰岛素水平及胰岛移植物存活时间.结果 LV-VEGF165组胰岛细胞体内外分泌的VEGF165浓度均显著高于LV-AcGFP1组和空白对照组（P＜0.01）.免疫组化检测LV-VEGF165组每平方毫米胰岛移植物平均微血管密度（MVD）为（24.3±3.7）,显著大于LV-AcGFP1组（12.4±2.5）及空白对照组（12.7±2.1,P＜0.01）,胰岛素染色强度于LV-VEGF165组高于LV-AcGFP1组及空白对照组.多元分析糖尿病大鼠血糖、胰岛素水平,LV-VEGF165组优于LV-AcGFP1组和空白对照组（P＜0.01）;LV-VEGF165组胰岛移植物于移植术后平均生存时间（MST）经log-rank检验长于LV-AcGFP1组及空白对照组（P＜0.01）.结论 转染VEGF165基因具有促进胰岛移植物的血管再生及提高胰岛移植效果的作用.

联合移植的血管内皮细胞对胰岛移植物血管重建及移植效果的影响

目的探讨联合移植的血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）对胰岛移植物血管重建及移植效果的影响。 方法分离纯化SD大鼠ECs和胰岛，移植于近交系SD雄性糖尿病大鼠背部皮下，设单纯胰岛移植组、联合ECs胰岛移植组、磷酸盐缓冲溶液对照组及正常对照组4组。免疫组化双染观察胰岛移植物血管化程度及胰岛细胞存活及凋亡状况，并比较各组大鼠腹腔葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）、腹腔胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT）结果，以及血糖、胰岛素水平及胰岛移植物存活时间。 结果多元分析大鼠IPGTT及IPITT血糖浓度、血糖及胰岛素水平，联合ECs胰岛移植组优于单纯胰岛移植组（P〈0.05）；联合ECs胰岛移植组胰岛移植物于移植术后平均生存时间经log-rank检验长于单纯胰岛移植组（P〈0.05）。移植7 d时，表达CD31的ECs于联合ECs胰岛移植组多于单纯胰岛移植组，血管计数结果显示，联合ECs胰岛移植组胰岛及周围平均微血管密度为26.4±6.1，显著高于单纯胰岛移植组的18.3±5.7（P〈0.05）。免疫组化双染，联合ECs胰岛移植组的胰岛素表达大于单纯胰岛移植组（P〈0.05），自杀相关因子（factor associated suicide, Fas）的表达则小于单纯胰岛移植组（P〈0.05）。 结论联合移植的ECs具有促进胰岛移植物的血管重建及提高胰岛移植效果的作用。

脂肪间充质干细胞与胰岛联合移植对术后免疫状态及移植效果的影响

目的研究同系脂肪间充质干细胞(AMSC)与同种异体胰岛联合移植对胰岛移植术后免疫状态及移植效果的影响。方法选择Lewis大鼠建立链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型作为胰岛移植受体,AMSC+胰岛移植组经左肾包膜下联合移植Lewis大鼠AMSC及Wistar大鼠胰岛,单纯胰岛移植组经左肾包膜下单独移植Wistar大鼠胰岛,单纯AMSC移植组经左肾包膜下单独移植Lewis大鼠AMSC,阳性对照组为未进行移植的Lewis糖尿病大鼠,阴性对照组为正常Lewis大鼠。ELISA法检测血清细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10浓度,流式细胞技术检测外周血CD4^+、CD8^+T细胞比例,HE染色观察移植胰岛淋巴细胞浸润情况,观察血糖、胰岛素水平及胰岛移植物存活时间。采用单因素方差分析比较5组大鼠外周血淋巴细胞亚群比例和血清细胞因子水平,采用LSD法进行组间两两比较;血糖及血清胰岛素变化采用重复测量资料方差分析;采用独立样本t检验比较AMSC+胰岛移植组与单纯胰岛移植组胰岛移植物淋巴细胞计数。采用Kaplan-Meier法绘制AMSC+胰岛移植组与单纯胰岛移植组胰岛移植物生存曲线,并采用log-rank检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果AMSC+胰岛移植组胰岛移植物平均生存时间为(26.8±3.0)d,长于单纯胰岛移植组的(19.0±1.3)d,两组大鼠胰岛移植物生存曲线差异有统计学意义(χ^2=4.494,P<0.05)。胰岛移植后各时间点,AMSC+胰岛移植组大鼠移植后血糖和胰岛素水平均优于单纯胰岛移植组(P均<0.05)。胰岛移植前,5组大鼠外周血CD4+、CD8+T细胞比例以及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10差异均无统计学意义(F=0.425、0.476、0.256、0.418、0.281和0.313,P均>0.05)。胰岛移植后第7、14、28天,AMSC+胰岛移植组大鼠外周血CD4+、CD8+T细胞比例均低于单纯胰岛移植组(P均<0.05),血清IFN-γ和IL-2浓度均低于单纯胰岛移植组(P均<0.05),IL-4和IL-10浓度均高于单纯胰岛移植组(P均<0.05)。胰岛移植第7天,AMSC+胰岛移植组胰岛移植物平均淋巴细胞计数为(142±21)个/mm^2,低于单纯胰岛移植组的(311±36)个/mm^2(t=8.245,P<0.05)。结论与胰岛联合移植的AMSC能够提高胰岛移植的效果,可调节糖尿病大鼠体内IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10表达及抑制同种异体胰岛刺激的T细胞增殖,减轻胰岛移植物的免疫损伤。

青藤碱对同种异体胰岛刺激淋巴细胞的免疫抑制作用

目的研究青藤碱(SIN)对同种异体胰岛刺激淋巴细胞的免疫抑制作用以及对胰岛活性和功能的影响。方法以Wistar大鼠胰岛作为刺激原,Lewis大鼠脾淋巴细胞作为反应细胞体外共同培养,分为4组:SIN组为SIN+胰岛+淋巴细胞共培养;他克莫司(Tac)组为Tac+胰岛+淋巴细胞共培养;阴性对照组为胰岛+淋巴细胞共培养;空白对照组为单纯淋巴细胞培养。四甲基噻唑蓝法检测各组淋巴细胞增殖情况,ELISA法检测上清液细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-10)浓度以及胰岛素分泌量,吖啶橙-碘化丙啶染色检测胰岛细胞活性。采用单因素方差分析比较4组混合淋巴细胞培养后OD值、细胞增殖率、上清液细胞因子浓度、胰岛素分泌量及胰岛素刺激指数等指标,采用LSD法进行组间两两比较。结果混合淋巴细胞培养第3天,阴性对照组、SIN组、Tac组和空白对照组OD值分别为0. 524±0. 048、0. 438±0. 032、0. 429±0. 037、0. 327±0. 026; SIN组OD值低于阴性对照组、高于空白对照组,差异均有统计学意义(P均<0. 05),但与Tac组相比差异无统计学意义(P> 0. 05)。计算淋巴细胞增殖率SIN组和Tac组分别为(33. 9±2. 8)%、(33. 2±3. 0)%,均低于阴性对照组(P均<0. 05),但SIN组和Tac组差异无统计学意义(P> 0. 05)。SIN组上清液IFN-γ、IL-2浓度分别为(67±6)、(322±21) pg/mL,均低于阴性对照组,高于空白对照组(P均<0. 05),但与Tac组差异无统计学意义(P> 0. 05);IL-10浓度为(76±4) pg/mL,高于其他3组,差异均有统计学意义(P均<0. 05)。SIN组高糖及低糖刺激下胰岛素分泌量分别为(14. 7±2. 1)、(8. 3±1. 2) m U/L,计算胰岛素刺激指数为1. 73±0. 24,胰岛细胞存活率为(82. 5±4. 7)%,均优于Tac组和阴性对照组(P均<0. 05)。结论 SIN对同种异体胰岛刺激的淋巴细胞具有免疫抑制作用,同时可减轻胰岛免疫损伤;与他克莫司相比,能更好地保持胰岛细胞活性及分泌功能。

应用No⁃touch技术分离血管对前臂桡动脉⁃头静脉内瘘成熟的影响

104例前臂桡动脉⁃头静脉内瘘(RC⁃AVF)手术患者被纳为研究对象,按血管分离的方法分为常规技术(CT)组及No⁃touch技术(NTT)组。术后12周观察期内NTT组内瘘头静脉内径及自然血流量均大于CT组(均P<0.05);术后第4周、第8周NTT组临床内瘘成熟率高于CT组(分别69.8%比49.2%,χ2=4.379,P=0.036;83.7%比65.6%,χ2=4.910,P=0.040);术后第4周、第8周、第12周NTT组影像学内瘘成熟率亦高于CT组(分别为76.7%比55.7%,χ2=4.856,P=0.028;86.0%比68.8%,χ2=4.083,P=0.043;93.0%比78.7%,χ2=3.981,P=0.046)。结果提示,与应用常规技术比较,应用No⁃touch技术分离血管构建RC⁃AVF可促进内瘘成熟并提高内瘘成熟率。

应用No-touch静脉分离技术构建前臂远端贵要静脉转位血管内瘘的临床效果

目的观察应用No-touch静脉分离技术分离贵要静脉构建前臂远端贵要静脉转位血管内瘘(BVTVF)的临床效果。方法回顾性分析济宁医学院附属日照市人民医院2007年12月至2016年3月成功实施的前臂远端BVTVF手术患者68例,其中2007年12月至2011年12月的患者采用常规静脉分离技术分离贵要静脉(36例,常规静脉分离技术组),2012年1月至2016年3月的患者采用No-touch静脉分离技术分离贵要静脉(32例,No-touch静脉分离技术组),比较两组患者术后24个月的观察期内血管内瘘的并发症发生率、失功率及通畅率。结果观察期内,常规静脉分离技术组并发症发生率均高于No-touch静脉分离技术组,两组比较差异有统计学意义(内瘘血管狭窄:33.3%比12.5%,P=0.043;假性动脉瘤:38.9%比15.6%,P=0.033;血栓形成:27.8%比6.3%,P=0.020);常规静脉分离技术组患者血管内瘘失功率高于No-touch技术静脉分离组,两组比较差异有统计学意义(36.1%比12.5%,P=0.025);常规静脉分离技术组血管内瘘通畅率经log-rank检验低于No-touch静脉分离技术组,两组比较差异有统计学意义(63.9%比87.5%,P=0.032)。结论与应用常规静脉分离技术比较,应用No-touch静脉分离技术分离贵要静脉构建前臂远端BVTVF能够减少血管内瘘并发症发生率,延长血管内瘘的使用时间。

青藤碱对家兔动静脉内瘘术后早期近吻合口静脉炎性反应及内膜增生的影响

目的探讨青藤碱(SIN)对家兔动静脉内瘘(AVF)术后早期近吻合口静脉炎性反应及内膜增生的影响。方法取20只雄性成年家兔,按照随机数字表法随机分为对照组和SIN组,每组10只。所有家兔左侧颈总动脉、颈总静脉端端吻合建立AVF,SIN组家兔AVF术后每天经臀部肌内注射SIN(45 mg/kg),对照组家兔AVF术后每天经臀部肌内注射等体积PBS液。术后第21天取AVF近吻合口静脉进行苏木精-伊红(HE)染色并测量其内膜厚度,计算内中膜厚度比值,免疫组织化学染色检测其内膜增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,蛋白印迹法检测其Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB p65(NF-κB p65)的表达。组间比较采用独立样本的t检验。结果对照组AVF近吻合口静脉内膜厚度、内中膜厚度比值[(24.0±3.9)μm、(38.1±6.5)%]较SIN组[(19.5±3.2)μm、(29.4±6.6)%]均增加,差异具有统计学意义(t=2.852,P<0.05;t=2.957,P<0.01);对照组AVF近吻合口静脉内膜细胞PCNA的阳性表达率高于SIN组,差异具有统计学意义[(19.7±3.3)%比(14.5±2.9)%,t=4.016,P<0.01],对照组AVF近吻合口静脉TLR4、NF-κB p65的相对表达量均高于SIN组,差异有统计学意义(0.530±0.085比0.273±0.051,t=8.196,P<0.01;0.804±0.143比0.435±0.096,t=6.751,P<0.01)。结论SIN能够减轻家兔颈总AVF术后早期近吻合口静脉炎性反应及内膜增生。