补阳还五汤促进大鼠局灶性脑缺血后血管生成和功能恢复

目的:研究补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠血管生成和神经功能恢复的影响。方法:采用线栓法诱导大鼠大脑中动脉阻塞,缺血90min后再灌,缺血后24h开始灌胃补阳还五汤,1天1次,连续14天,在缺血后第1、3、7、14天分别采用肢体放置实验、错步实验和粘胶揭除实验评价感觉运动功能;采用免疫组化检测缺血周边区微血管密度(microvessels density,MVD)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达。结果:与模型组比较,补阳还五汤不仅能显著提高肢体放置实验成绩,减少错步次数和缩短粘胶揭除潜伏期(P<0.05或P<0.01),而且能显著增加缺血周边区vWF阳性血管和VEGF阳性细胞数量(P<0.01)。结论:补阳还五汤能促进脑缺血后神经功能恢复,机制可能与其促进缺血周边区血管生成和VEGF表达有关。

SIRT1对高糖诱导的系膜细胞NF-κBp65乙酰化及MCP-1表达的影响

目的探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(RMC)核因子κB(NF-κB)p65蛋白乙酰化及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达的影响。方法构建干扰SIRT1基因的shRNA慢病毒质粒pTRCshSIRT1并进行鉴定。将RMC分为高糖组(用高糖培养液培养)、白藜芦醇(SIRT1激活剂)+高糖组(用含1μmol/L白藜芦醇的低糖培养液培养24h后,换用高糖培养液培养)、SIRT1RNAi组(添加干扰病毒pTRC-shSIRT1感染4h后,换用低糖培养液培养)、SIRT1RNAi+高糖组(添加干扰病毒pTRC-shSIRT1感染4h后,换用高糖培养液培养),同时设正常对照组和甘露醇高渗对照组。以实时荧光定量PCR检测SIRT1、MCP-1的mRNA表达,蛋白质印迹法检测SIRT1和NF-κB p65乙酰化蛋白的表达,ELISA技术检测MCP-1蛋白含量。结果质粒测序证实干扰SIRT1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,且能抑制RMC中SIRT1基因表达(P<0.01)。高糖刺激使RMC SIRT1基因表达降低,NF-κB p65蛋白乙酰化增强,MCP-1mRNA和蛋白水平增高;SIRT1激活剂白藜芦醇可逆转高糖引起的变化;而沉默SIRT1可促进高糖诱导的RMC NF-κB p56乙酰化及MCP-1mRNA和蛋白表达(P<0.05或0.01)。结论 SIRT1可抑制高糖诱导的RMC MCP-1表达,其机制可能与NF-κB p56去乙酰化有关。

Salusin-β对缺血/再灌注心肌损伤的影响

目的:探明salusin-β——一种新发现的心血管调节肽是否具有抗心肌缺血/再灌损伤(RMMI)的作用。方法:以离体灌流大鼠的心脏RMMI为模型,分为对照组和salusin-β预处理组,观察各组大鼠心脏缺血/再灌注(I/R)后的心率(HR)、冠脉流量(CF)和心功能[左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)和左室内压上升、下降速率(±dp/dt)]的变化。结果:以10-8mol/L的salusin-β预处理,可以改善心脏I/R后CF、LVDP、LVEDP、+dp/dt和-dp/dt等指标。10-8mol/L salusin-β组复灌30 min时,CF、LVDP、+dp/dt和-dp/dt的恢复率,分别是停灌前的(52±5)%、(79±8)%、(70±8)%和(69±10)%,显著高于对照组的(45±6)%、(68±10)%、(58±11)%和(57±8)%(P<0.01,n=8)。此外,10-8mol/L salusin-β组复灌30 min时,LVEDP为(28.25±7.62)mmHg,显著低于对照组的(52.52±11.27)mmHg。结论:上述结果表明,salusin-β具有抗心肌RMMI、改善I/R后心脏功能的作用。

补阳还五汤及其拆方对大鼠脑缺血后神经发生的影响

目的研究补阳还五汤及其拆方对大鼠局灶性脑缺血后神经发生(neurogenesis)的影响及作用机制。方法采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型,缺血90 min后再灌注,分假手术组、模型组、补阳还五汤组、补气组、活血组,缺血后24 h灌胃给药,连续14天。并腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU),1次/天,连续14天。在缺血后第1、7、14天,采用改良的神经症状严重程度评分(mNSS)和角实验评价神经功能;缺血后第14天,采用免疫荧光双标检测BrdU/Nestin、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP免疫阳性细胞,Western blot检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达。结果与模型组比较,全方组及补气组大鼠mNSS评分降低和右转次数减少(P<0.05,P<0.01),侧脑室下区BrdU/Nestin免疫阳性细胞、缺血皮层周边区BrdU/NeuN和BrdU/GFAP免疫阳性细胞数量增多(P<0.05,P<0.01),BDNF和VEGF蛋白表达增加(P<0.01);但补气组BrdU/GFAP差异无统计学意义(P>0.05),活血组各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。与全方组比较,补气组和活血组大鼠BrdU/Nestin、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP免疫阳性细胞显著减少(P<0.01),BDNF和VEGF蛋白表达下降(P<0.01)。结论补阳还五汤能显著促进脑缺血后神经发生和神经功能恢复,机制可能与上调BDNF和VEGF蛋白有关,方中补气药和活血药具有协同作用。

川芎嗪上调MMP-2、MMP-9表达促进骨髓间充质干细胞迁移

目的体外研究川芎嗪(Ligustrazine)对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)迁移及基质金属蛋白酶-2、9(matrix metalloproteinase-2,9,MMP-2、9)表达的影响。方法采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,采用流式细胞仪检测BMSCs阳性抗原(CD29和CD90)及阴性抗原(CD34和CD45),鉴定BMSCs纯度;将BMSCs分成对照组,川芎嗪25、50、100μmol/L组和GM6001组(100μmol/L川芎嗪加MMPs抑制剂GM6001);川芎嗪处理24 h,采用Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验检测细胞迁移速度;Western blot检测BMSCs的MMP-2、MMP-9蛋白表达。结果第3代BMSCs生长良好、形态均一,BMSCs阳性抗原CD29、CD90表达率分别为96.9%、97.3%,阴性抗原CD34、CD45表达率分别为0.2%、3.0%。与对照组比较,川芎嗪各剂量组迁移的细胞数量、细胞侵袭相对距离增加,BMSCs的MMP-2和MMP-9蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。与川芎嗪100μmol/L组比较,川芎嗪25、50μmol/L组和GM6001组迁移的细胞数量、细胞侵袭相对距离减少(P<0.01);川芎嗪25、50μmol/L组MMP-2蛋白表达降低(P<0.01)。结论川芎嗪能在体外促进BMSCs的迁移,作用机制与其上调MMP-2、MMP-9蛋白表达有关。

补阳还五汤上调miRNA-210表达促进人脑微血管内皮细胞血管生成

目的体外研究miRNA-210在补阳还五汤(Buyang Huanwu Decoction,BYHWD)促进人脑微血管内皮细胞(HBMECs)血管生成中的作用及其机制。方法制备BYHWD含药血清,脂质体2000将miRNA-210inhibitor转染至HBMECs,HBMECs分为空白血清组(10%正常对照血清)、BYHWD含药血清组(10%BYHWD含药血清)、miRNA-210inhibitor阴性对照组(NC 10%BYHWD含药血清+miRNA-210inhibitor NC)和miRNA-210inhibitor组(10%BYHWD含药血清+miRNA-210inhibitor);采用MTT、Transwell和管腔形成实验分别检测HBMECs增殖、迁移和管腔形成;qRT-PCR检测miRNA-210、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)mRNA表达,Western Blot检测VEGF和VEGFR2蛋白表达。结果与空白血清组比较,BYHWD含药血清组HBMECs增殖、迁移和管腔形成增加(P<0.01),miRNA-210、VEGF和VEGFR2mRNA和蛋白表达增加(P<0.01)。与BYHWD含药血清组比较,miRNA-210inhibitor组HBMECs增殖、迁移和管腔形成减少(P<0.01),VEGF、VEGFR2mRNA和蛋白表达减少(P<0.01)。结论 BYHWD可促进HBMECs血管生成,其机制可能与其上调miRNA-210表达激活VEGF信号通路有关。

补阳还五汤对小鼠局灶性脑缺血后生长相关蛋白43和突触素表达的影响

目的观察补阳还五汤对小鼠局灶性脑缺血后生长相关蛋白43（GAP-43）和突触素（SYP）表达的影响。方法36只KM小鼠随机分成假手术组（n=12），模型组（n=12）和补阳还五汤组（n=12）。大脑中动脉阻塞（MCAO）30min诱导小鼠局灶性脑缺血，缺血后24h开始灌服补阳还五汤，每天1次，缺血后第1，3，7，14天分别采用神经症状评分和角实验评价神经功能；缺血后第14天，采用免疫组化检测缺血周边区GAP-43和SYP的表达。结果与模型组比较，补阳还五汤在缺血后第3，7，14天能显著改善神经症状（P〈0．05），第7，14天能显著减少小鼠右转次数（P〈0．05）；脑缺血后14d，模型组GAP-43和SYP平均光密度值分别为0．217±0．012，0．278±0．019，而补阳还五汤组分别为0．250±0．013，0．323±0．017，两组之间差异有统计学意义（P〈0．01）。结论补阳还五汤促进脑缺血后神经功能恢复可能与其促进缺血周边区神经轴突再生和突触可塑性有关。

骨髓间充质干细胞移植对脑缺血后血管生成和功能恢复的影响

目的 研究骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）移植对脑缺血后血管生成和神经功能恢复的影响.方法 采用全骨髓贴壁法进行BMSCs原代培养,流式细胞仪鉴定BMSCs阳性抗原（CD29和CD90）及阴性抗原（CD34和CD45）;采用线栓法复制大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型,缺血90 min再灌注,分为假手术组（n=12）、模型组（n=12）和BMSCs组（n=12）.缺血后24h,BMSCs组经尾静脉注射1 ml BMSCs（1×10^6/ml）,假手术组和模型组经尾静脉注射1 ml PBS.在缺血后第1、7、14和28天分别采用改良的神经症状严重程度评分（mNSS）、角实验和粘胶揭除实验评价神经功能;缺血后第28天,采用甲苯胺蓝染色检测脑梗死体积;缺血后第14 d,免疫荧光检测缺血周边区微血管密度和血管内皮生长因子（VEGF）表达.结果 第3代BMSCs生长良好、形态均一,呈梭形,阳性抗原CD29、CD90表达率分别为98.3％、97.4％,阴性抗原CD34、CD45表达率分别为0.2％、4.8％;与模型组比较,BMSCs组大鼠在缺血后第7,14,28天mNSS评分显著降低（P＜0.01）,第14,28天右侧转身次数减少（P＜0.05）,第7天粘胶揭除时间显著缩短（P＜0.05）,脑梗死体积显著减少（P＜0.01）;缺血后第14天,模型组大鼠缺血周边区vWF阳性血管数量和VEGF免疫阳性细胞数量分别为（42.97±8.64）个/mm^2,（54.83±10.66）个/mm^2,而BMSCs组分别为（69.43±7.29）个/mm^2,（78.70±6.16）个/mm^2,两组之间差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 BM-SCs移植能促进脑缺血后神经功能恢复,机制可能与其上调VEGF表达促进缺血周边区血管生成有关.

补阳还五汤对局灶性脑缺血小鼠血管生成和Ang-1／Tie-2表达的影响

目的观察补阳还五汤对局灶性脑缺血小鼠血管生成和血管生成素－1（Ang-1）及其受体Tie－2表达的影响。方法35只KM小鼠分成假手术组（n=10），模型组（n=12）和补阳还五汤组（n=13）。大脑中动脉阻塞（MCAO）30min诱导小鼠局灶性脑缺血，缺血后24h开始灌服补阳还五汤，1次／d，缺血后28d内分别采用神经症状评分和角实验评价神经功能；缺血后第28天，采用免疫组化检测缺血周边区微血管密度和Ang－1／Tie－2的表达。结果缺血后第3～28天，补阳还五汤能显著改善神经症状和减少小鼠右转次数，与模型组比较差异有显著性（P〈0．05）；脑缺血后28d，模型组CD31、Ang－1、和Tie－2免疫阳性细胞增多[分别为（437±59）个，（389±61）个，（251±42）个]，而补阳还五汤组为[分别为（609±68）个，（551±66）个，（342±46）个]，两组之间差异有显著性（P〈0．01）。结论补阳还五汤促进脑缺血后神经功能恢复可能与其上调Ang－1／Tie－2表达促进缺血周边区血管生成有关。

去甲二氢愈创木酸部分抑制大鼠局灶性脑缺血后炎症反应

本实验旨在观察去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid,NDGA)对大鼠局灶性脑缺血后炎症细胞聚集的作用及其机制。在大鼠大脑中动脉阻塞30min后进行再灌注72h,在再灌注30min,2、24、48h时分别腹腔注射一次NDGA(5、10mg/kg)。再灌注72h后检测脑损伤、内源性IgG渗出、中性粒细胞和巨噬细胞/小胶质细胞聚集、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)mRNA和蛋白表达,并在再灌注3h后检测脑内5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LOX)的催化产物白三烯B4(leukotriene B4,LTB4)和半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes,CysLTs)含量。结果显示:NDGA能显著改善脑损伤,减少内源性IgG渗出、中性粒细胞浸润、ICAM-1mRNA和蛋白表达,同时降低脑内LTB4和CysLTs含量,但对巨噬细胞/小胶质细胞聚集没有影响。上述结果提示,NDGA对脑缺血亚急性期炎症反应的抑制主要表现为减少中性粒细胞浸润,机制可能与抑制5-LOX激活有关。