蟾蜍灵在体内外抑制急性红白血病细胞K562增殖及下调WT1表达的研究

目的研究蟾蜍灵在体内外抗K562细胞增殖及对WT1表达影响。方法半固体集落形成实验检测蟾蜍灵对K562细胞的增殖抑制作用,流式细胞术分析蟾蜍灵对K562细胞周期的影响,Western blot观察蟾蜍灵对WT1表达作用。通过高致瘤性K562细胞制备裸鼠皮下荷瘤模型,分组为模型组、蟾蜍灵组及高三尖杉酯碱组,比较各组皮下瘤体积与重量、病理形态学改变及WT1蛋白表达情况。结果①半固体集落形成实验、流式及Westem blot结果显示,蟾蜍灵能明显抑制K562细胞增殖,阻滞细胞在G_0/G_1期,并下调其WT1蛋白表达,呈剂量依赖性;②蟾蜍灵组和阳性对照组裸鼠肿瘤的抑瘤率均明显高于模型组(P<0.05),且蟾蜍灵组和阳性对照组裸鼠皮下瘤重量均明显低于模型组(P<0.05);③病理切片显示,蟾蜍灵导致K562皮下瘤组织内肿瘤细胞大量坏死、凋亡,继发出血及纤维化等改变;并明显抑制K562皮下瘤组织中WT1蛋白表达水平。结论蟾蜍灵在体外可抑制K562细胞增殖及阻滞细胞周期于G_0/G_1期并下调其WT1蛋白表达,在体内可明显抑制裸鼠K562皮下瘤体积和重量,导致皮下瘤组织坏死、凋亡,并可下调其WT1蛋白的表达。

高白细胞性急性髓系白血病细胞基因表达谱的研究

[目的]综合分析高白细胞性急性髓系白血病不同预后患者祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性以及差异表达的基因。[方法]半固体集落形成法观察不同预后患者骨髓祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性。采用Affymetrix公司人类寡核苷酸表达谱芯片检测患者初诊时骨髓单个核细胞基因表达谱,筛选出差异表达数据。[结果](1)患者骨髓祖细胞集落形成和化疗药物的敏感性与预后密切相关,未缓解者的骨髓祖细胞集落明显高于完全缓解患者,且对化疗药物不敏感。(2)完全缓解患者白血病细胞表达上调2倍以上的基因109条,占0.5%。下调2倍以上的基因134条,占0.6%,其中与预后密切相关的为TRIM16、TM4SF1。CD34和DNMT3B。(3)差异表达的基因按功能分成离子通道运输、细胞周期、细胞骨架运动、细胞凋亡等14类。上调的主要为DNA合成修复、细胞凋亡、细胞周期和应激相关等4类;而下调的主要为蛋白翻译合成、信号传导传递、发育相关和细胞骨架运动等4类。[结论]特定的基因表达模式决定患者预后。

七叶皂苷钠诱导人单核白血病SHI-1细胞凋亡的研究

目的研究七叶皂苷钠对人急性单核白血病细胞株SHI-1细胞的抑制增殖及诱导凋亡的作用。方法 SHI-1细胞经不同浓度的七叶皂苷钠处理后,MTT法分析七叶皂苷钠对SHI-1细胞增殖的抑制作用,AnnexinⅤ/PI染色流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,DNA凝胶电泳观察凋亡特异性DNA降解梯形条带,半定量PCR检测凋亡特异性酶Caspase-3 mRNA表达水平。结果MTT法显示七叶皂苷钠能显著抑制SHI-1细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。经不同浓度的七叶皂苷钠处理24h,AnnexinⅤ/PI染色显示AnnexinⅤ阳性的凋亡细胞率明显上升,DNA琼脂糖凝胶电泳分析出现凋亡特异性的DNA降解梯形条带,半定量PCR显示Caspase-3 mRNA表达水平随药物浓度增加而升高(P<0.05)。结论七叶皂苷钠对SHI-1细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用,可能是其抗白血病作用途径之一。

人参二醇组皂苷提取物对再生障碍性贫血小鼠免疫调节作用的研究

目的观察自行提取分离的中药新药人参二醇组皂苷提取物(PDS-C)对再生障碍性贫血(再障)小鼠促进造血和调节免疫的作用。方法 BALB/c小鼠经亚致死量照射后输入DBA/2小鼠的淋巴细胞,制成免疫介导型再障模型。实验分6组,正常小鼠、模型组、PDS-C低、中和高剂量治疗组及环孢素阳性药物对照组,均灌胃给药15 d。检测外周血象、骨髓病理检查造血组织增生状况、脾脏T细胞亚群比例,及T细胞分化相关T-bet、GATA-3和FOXP3转录调控蛋白的表达水平。结果 PDS-C治疗再障小鼠的疗效明显,中、高剂量组的外周血红蛋白、白细胞和血小板计数均明显高于模型组,骨髓造血组织增生状况也明显优于模型组。PDS-C升高Th2细胞和调节性T细胞(Treg)的比例,降低Th1细胞比例,并上调GATA-3和FOXP3蛋白及下调T-bet蛋白的表达。结论 PDS-C有效地促进造血,改善再障的骨髓抑制,加快造血功能恢复而升高外周血象;同时通过恢复再障小鼠失衡的Th1/Th2/Treg细胞比例而参与调节免疫,该文为PDS-C的临床应用提供实验依据。

人参总皂苷增强成骨分化的间充质干细胞促造血作用研究

目的观察人参总皂苷(TSPG)诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的作用,探讨TSPG增强成骨分化的间充质干细胞促造血的可能机制。方法贴壁法培养人源骨髓间充质干细胞(h MSCs),成骨细胞分化和免疫表型进行鉴定。不同剂量的TSPG联合成骨细胞条件诱导液培养h MSCs,MTT法检测细胞增殖活性,对-硝基苯磷酸盐(p NPP)法检测培养上清碱性磷酸酶含量,茜素红染色法观察钙结节数量,Western blot法检测成骨细胞分化转录因子-核心结合蛋白因子2(RUNX2)蛋白表达水平,Elisa法检测培养上清造血相关因子含量,造血祖细胞集落生成实验检测培养上清造血支持能力。结果 MTT和p NPP结果均显示随着TSPG剂量增加,吸光值逐渐增加,呈剂量依赖性。钙结节数量和RUNX2蛋白表达水平明显高于对照组。造血相关生长因子和造血祖细胞集落数明显高于对照组。结论TSPG通过上调RUNX2蛋白表达诱导h MSCs向成骨细胞分化,同时增强成骨分化的MSCs支持造血。

白藜芦醇对K562白血病细胞抑制增殖和诱导分化的作用

目的探索白黎芦醇对K562白血病细胞株的抑制增殖和诱导分化作用。方法不同浓度的白黎芦醇处理K562白血病细胞6 d后,利用半固体集落生成实验检测K562白血病细胞集落数;通过细胞免疫化学法和Western-blot法检测分化相关转录因子GATA-1和PU.1蛋白表达情况;流式细胞术检测分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b阳性细胞的表达率。结果白黎芦醇能够降低K562白血病细胞集落数,且呈剂量依赖性(P<0.05);提高分化相关转录因子GATA-1和PU.1蛋白表达水平,升高K562细胞分化相关抗原CD11b、CD14、CD42b的表达阳性的细胞率,呈剂量依赖性(P<0.05)。结论白黎芦醇可能通过上调GATA-1和PU.1蛋白表达和升高CD11b、CD14和CD42b表达阳性的细胞率,诱导K562细胞向红系、粒系和巨核系方向分化,并抑制其增殖。

地西他滨抑制K562白血病细胞增殖和诱导分化的作用

目的:观察地西他滨(DAC)抑制白血病K562细胞生长和诱导分化的作用。方法:不同浓度的DAC处理K562细胞。MTT法和半固体集落生成实验检测K562细胞增殖能力;瑞氏染色观察细胞形态;流式细胞术检测分化相关抗原CD11b和CD42b阳性表达率;Western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)、细胞周期负调控因子P27、红系分化核转录因子GATA-1及粒系分化核转录因子PU.1蛋白的表达水平。结果:DAC能够减少K562细胞集落形成的数量,降低细胞活力,减少核质比,抑制K562细胞进入S期,并阻滞在G_2/M期,提高分化相关抗原CD11b和CD42b阳性表达率,上调P27、GATA-1和PU.1蛋白表达,同时下调CDK2和cyclin E1蛋白表达。结论:DAC可能通过调控细胞周期抑制K562细胞增殖,同时诱导多向分化。

三七总皂苷诱导造血细胞基因表达谱的体外实验研究

目的采用cDNA芯片技术分析三七总皂苷(PNS)诱导造血细胞的基因表达谱,探讨上调基因与细胞增殖、分化的相关性。方法选择增殖、分化相关重要的功能基因480个,制备cDNA膜芯片。人造血细胞巨核系CHRF-288、粒系HL-60和红系K562细胞经PNS处理后,分别提取mRNA,经逆转录后用〔α-33P〕dATP标记,与芯片的cDNA杂交。结果PNS诱导表达上调3倍以上的基因按功能分11类,包括甲基和乙酰化转移酶、诱导分化、抑制凋亡、转录调控蛋白、周期蛋白、信号传递介导蛋白和激酶、受体、DNA和RNA聚合酶,以及大鼠肉瘤(RAS)基因家族等。PNS诱导CHRF-288、HL-60和K562细胞后,mRNA表达水平上调3倍以上的基因分别为78条、89条和59条,占检测基因总数的16.3%、18.5%和12.3%。结论PNS诱导上调的基因均与细胞增殖和分化相关,与我们报道的血液病动物模型、造血干/祖细胞、基因转录调控和蛋白激酶等研究结果相符,为PNS的作用提供了基因表达谱方面的有力证据。

Th17/Treg细胞失衡与再生障碍性贫血研究进展

再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是一种以效应T细胞功能亢进导致造血组织损伤为特征的自身免疫性疾病。近年来研究发现,AA与Th17细胞数量增加及Treg细胞数量减少密切相关,且Th17和Treg细胞功能上相互拮抗。动物实验表明,IL-17抗体靶向治疗及Treg细胞回输治疗均可改善免疫介导的AA小鼠骨髓衰竭状态。本文就Th17/Treg细胞与AA关系最新研究进展作一综述,旨在进一步探讨AA发病机制,为临床治疗提供新思路。本综述讨论的主要问题有:Th17/Treg细胞一般生物学特性,Th17/Treg细胞平衡的调节及相关细胞因子,Th17/Treg细胞与再生障碍性贫血关系等。

小鼠半相合移植物抗宿主病体内、外实验体系的建立及应用

[目的]建立观察小鼠移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease,GVHD)的体、内外实验体系。[方法]体外实验体系包括MTT法观察单向混合淋巴反应(MLR)中供鼠淋巴细胞增殖;采用PHA活化供鼠T淋巴细胞,Annexin V/PI双染法检测T细胞凋亡率,观察细胞周期变化及不同时间的CD25和CD69表达率。选择经典GVHD防治药物环孢菌素A(cyclosporin A,CSA)和地塞米松(dexamethasone,Dexa)验证体外实验体系的有效性。以CB6F1为受鼠,60Co全身照射清髓,输入供鼠的骨髓和脾细胞,建立稳定的小鼠半相合骨髓移植GVHD模型,为体内实验体系,观察GVHD的程度、生存期及CSA和Dexa的疗效。[结果]CSA和Dexa能显著抑制单向MLR中供鼠效应T淋巴细胞增殖,诱导PHA活化后T淋巴细胞凋亡率增加。CSA和Dexa对T细胞的细胞周期影响包括亚二倍体凋亡峰的比例明显增加、G0/G1期比例增加和S期比例减少。CSA和Dexa还能降低GVHD同种反应T细胞的标志CD25和CD69的表达。建立稳定的小鼠半相合骨髓移植GVHD模型,CSA和Dexa均能减轻GVHD的程度,延长生存期,以CSA为佳。[结论]形成体外观察供鼠GVHD同种反应T细胞增殖、活化的实验体系,建立稳定的小鼠GVHD模型,采用CSA和Dexa验证了其药物筛选的有效性。

七叶皂苷诱导HL-60细胞凋亡的研究

本研究观察七叶皂苷对髓系白血病HL-60细胞的抑制和诱导凋亡作用。取对数期生长的HL-60细胞经饥饿处理后,加入不同浓度的七叶皂苷观察七叶皂苷抑制细胞生长的指数、形态学变化,用DNA片段凝胶电泳(DNA Ladder)和Annexin V/PI-FITC双标法分析诱导细胞凋亡的作用。结果表明:七叶皂苷抑制HL-60细胞生长,15-120mg/L的七叶皂苷处理细胞48小时后,存活率为(92.2±0.69)%-(8.2±0.96)%,均明显低于不加药的对照组(99.4±0.31)%(p均<0.05);七叶皂苷15-60mg/L处理细胞24小时后细胞发生凋亡。Annexin V/PI分析显示,给药组AnnexinV阳性细胞为(12.7±0.58)%-(65.4±1.30)%,明显高于对照组的(0.57±0.03)%(p均<0.01)。七叶皂苷处理的细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示典形的凋亡DNA梯形条带。结论:七叶皂苷能特异性地诱导HL-60细胞凋亡,此研究结果为七叶皂苷今后作为治疗白血病的辅助药物提供实验依据。

异基因骨髓移植小鼠肠道菌群和NLRP3炎症小体改变与急性移植物抗宿主病发生发展的关系

目的:探讨异基因骨髓移植小鼠肠道菌群和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体改变与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的关系。方法:建立C57BL/6雄性小鼠致BALB/c雌性小鼠异基因骨髓移植模型,诱导aGVHD为aGVHD组,以BALB/c雌性小鼠为对照,ELISA方法检测模型组小鼠血清白细胞介素1β(IL-1β)、IL-4、IL-10和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,免疫组化检测肠闭合蛋白(occludin)的表达,检测16S rDNA以评估肠道菌群改变,HE染色观察aGVHD靶器官(肺、肝、脾和回肠)的病理变化,Western blot分析肠组织NLRP3炎症小体的表达。结果:与正常小鼠相比,aGVHD小鼠血清IL-1β和TNF-α水平明显上升,而IL-4和IL-10水平下降(P<0.01);aGVHD小鼠肠紧密连接蛋白occludin表达下降,其肠道菌群也发生改变,表现为疣微菌门(Verrucomicrobia)等微生物物种富集,而红蝽杆菌目(Coriobacteriales)等多个微生物种类下调;aGVHD组靶器官病理损伤明显,NLRP3炎症小体表达显著增加。结论:aGVHD可能通过炎症因子影响小鼠肠道屏障功能,改变肠道菌群,进而激活NLRP3炎症小体,导致恶性循环。

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。

人参总皂苷促进再生障碍性贫血小鼠造血及其机制探讨

目的:观察人参总皂苷(TSPG)对免疫介导型再生障碍性贫血(再障)小鼠的疗效及其相关作用机制。方法:BALB/c小鼠经亚致死剂量照射后输入DBA/2小鼠淋巴细胞,制成再障小鼠模型。实验分6组,正常小鼠组,模型组,TSPG低、中和高剂量治疗组,环孢菌素A(Cs A)阳性对照组,灌胃给药15 d。观察外周血象,检测血清Th1/Th2/Th17因子含量、骨髓造血祖细胞集落生成率及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)的磷酸化水平。结果:TSPG治疗再障小鼠的疗效显著,中、高剂量组的血红蛋白含量、白细胞和血小板计数均明显高于模型组;红、粒和巨核系造血祖细胞集落生成率均明显高于模型组。同时,显著上调骨髓细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达,降低血清Th1和Th17因子含量,并升高Th2因子含量。结论:人参总皂苷有效地治疗再障小鼠,具有一定程度的促进造血和调节免疫的功效,其作用机制可能是调节Th1/Th2/Th17因子的表达及ERK1/2的磷酸化。

低极性人参皂苷Rh4对白血病细胞系K562细胞增殖抑制及诱导分化作用的研究

人参是我国传统中药，其主要药理成分人参皂苷具有抗白血病作用。人参皂苷Rh4是一类仅结合1个糖基的人参三醇型皂苷，属于低极性人参皂苷，具有适中的肠吸收极性，更易进入体内发挥作用，具备较其他多糖基皂苷更高的生物利用度。Rh4具有抗黑色素瘤、抑制黑色素合成的作用，对白血病细胞系P388细胞和L1210细胞具有细胞毒活性。本研究中我们观察人参皂苷Rh4对白血病细胞系株K562细胞增殖及分化的作用，现报道如下。

大黄素对HL-60细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨大黄素对人白血病细胞HL-60增殖及凋亡的影响。方法:应用MTT法检测大黄素对HL-60细胞增殖的影响;应用流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡;蛋白印迹法(Western-Blot)检测Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果:在5～20mg/L浓度范围内,大黄素对HL-60细胞增殖的抑制作用呈时间剂量依赖性20mg/L作用72h后,抑制率分别达到(19.8±2.7)%,(58.8±4.4)%和(73.8±5.7)%;流式细胞术检测发现:大黄素5、10和20mg/L作用24h后,细胞凋亡率分别为(15.5±3.4)%、(56.0±3.4)%和(71.1±5.0)%,与对照组(1.01±0.06)%有显著性差异(P<0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的梯形条带。大黄素作用24h后,Bcl-2蛋白的表达水平随药物波度增加呈逐渐下降趋势。结论:大黄素能够抑制HL-60细胞增殖,并诱导其凋亡。Bcl-2基因可能参与了大黄素抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡的过程。

免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞成骨及成脂潜能改变

[目的]探讨免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞(msenchymal stem cell,MSC)向成骨及成脂肪细胞分化潜能的改变。[方法]采用免疫介导法进行再障造模,Babl/c小鼠经60Co射线亚致死剂量照射后,自尾静脉输入DBA/2小鼠的淋巴细胞建立免疫介导型再生障碍性贫血小鼠模型;造模15天后进行再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞培养,并检测骨髓成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)数量变化,观察模型小鼠骨髓病理改变;茜素红和油红O分别检测模型小鼠MSC钙结节数和脂肪细胞形成率。[结果]再障模型小鼠CFU-F数明显减少;骨髓病理切片显示,造血组织减少,并脂肪化;再障小鼠MSC钙结节数量减少,脂肪细胞分化率显著增加。[结论]免疫介导再生障碍性贫血小鼠MSC成骨潜能减弱,成脂潜能明显增强。

氨磷汀联合地塞米松治疗复发难治性ITP临床观察

原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,ITP）,既往亦称特发性血小板减少性紫癜,是以血小板免疫性破坏伴巨核细胞成熟障碍导致外周血小板减少的出血性疾病.糖皮质激素是公认的ITP治疗首选药物,而脾切除则是对激素治疗失败患者的第一选择,但往往难以被患者接受.目前对于糖皮质激素治疗无效或切脾无效的ITP患者的治疗仍相当困难,存在缓解率低、疗效难以维持、不良反应明显以及价格昂贵不能有效地广泛应用等问题.近年研究表明,氨磷汀（Amifostine,AMF）为一种细胞保护剂,治疗ITP有效且安全[1-2].笔者应用氨磷汀联合地塞米松（Dexamethasone,DXM）治疗复发难治性ITP 29例,现报道如下.

蛇六谷石油醚提取物对K562细胞生物学特性的影响及其机制

目的:探讨蛇六谷石油醚提取物(SLG)抑制白血病K562细胞增殖、促进凋亡和诱导分化的作用。方法:SLG处理K562细胞,同时加入ERK信号通路阻滞剂PD98059。采用MTT检测细胞活力,采用流式细胞术检测细胞凋亡率及分化相关抗原表达阳性的细胞比例,采用Western blot检测ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达水平。结果:SLG 50、100、200 mg/L能够降低K562细胞的增殖活力,其抑制作用呈剂量依赖性(r=0.9997)。SLG能够提高细胞凋亡率及分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b表达阳性的细胞比例,同时能够上调p-ERK1/2的表达。PD98059可部分逆转SLG促凋亡和分化的作用。结论:SLG通过ERK信号通路抑制K562细胞增殖、促进凋亡和诱导分化。

放射线对小鼠T细胞分化相关蛋白T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp 3表达的影响

目的:观察放射线对小鼠脾脏T细胞分化特异性转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3蛋白表达水平的影60响。方法:Coγ射线(1.0 Gy,5.5 min)照射Balb/c小鼠,分别于照射后第4、8、12及20天检测小鼠外周血象;骨髓病理切片观察骨髓造血组织增生情况;Western Blot法检测脾脏T细胞分化特异性转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp 3蛋白表达水平。结果:γ射线照射后小鼠外周血白细胞和血小板数量显著降低;骨髓造血细胞显著减少,脂肪细胞明显增多;放射线照射Balb/c小鼠,脾脏GATA-3、RORγt、Foxp 3蛋白表达下降,于照射后第4天表达水平最低,之后逐渐升高但低于正常对照组水平(P<0.05);脾脏T-bet蛋白表达水平明显高于对照组水平(P<0.05);T-bet/GATA3、RORγt/Foxp3比值明显增大(P<0.05),于照射后第4天比值最大。结论:放射线抑制Balb/c小鼠骨髓造血,同时导致脾脏T细胞分化异常;骨髓造血功能低下可能与T细胞分化异常相关。