禽呼吸道7种病毒多重连接探针扩增检测技术的建立与应用

建立了一种多重连接探针扩增技术(MLPA),能快速区分临床上引起禽呼吸道疾病的7种病原,即禽流感病毒(AIV)H9亚型、AIV H5亚型、AIV H7亚型、新城疫病毒(NDV)、禽偏肺病毒(aMPV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)和禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)。对扩增产物进行毛细管电泳分析,结果显示,该方法对不同病原核酸的最低检测极限可以达到5.3×10^0~1.40×10^2拷贝/反应,特异性好,探针之间无交叉反应。应用MLPA方法对122份临床样品进行检测,并与国家或行业标准进行比较,结果显示AIV H7亚型、NDV、aMPV、IBV、ILTV的特异性和敏感性均达到100%。结果与国家或行业标准PCR方法的检测结果一致性高,且克服了国家或行业标准PCR方法无法进行多重检测的缺点。该方法最多可同时检测40多种病原,对于复杂症候群的快速和高通量检测具有重要临床意义,可推广到其他多重病毒的检测中,显示出广阔的应用前景。

镉暴露诱导小鼠肝脏铁死亡的作用机制

镉(Cd)是一种重要的环境污染物,可造成蓄积机体包括肝脏在内多种器官的损害。本研究旨在揭示Cd暴露对小鼠肝脏组织铁死亡的作用及其机制。24只8周龄ICR小鼠随机平均分为对照组和3个Cd暴露组(Cd组),Cd组每日给小鼠腹腔注射1、2、3 mg/kg的氯化镉(CdCl2),对照组注射等体积的生理盐水,连续7 d。8 d后处死小鼠,分别观察肝脏组织病理学及超微结构变化,检测血清中肝功能酶(ALT、AST)活性,肝脏组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和Cd的含量,检测铁死亡相关因子的蛋白表达水平。结果显示,Cd暴露后肝脏组织间质充血,肝脏细胞索消失、线粒体出现絮状致密物,嵴缺失空化。Cd暴露组小鼠血清ALT和AST,肝脏组织MDA和Cd含量显著升高,肝脏组织GSH-Px含量显著下降(P<0.01)。肝脏组织ACSL4、HO-1蛋白表达量极显著升高(P<0.01),GPX4、SLC7A11、FTH1、FTL蛋白的表达量则极显著下降(P<0.01)。结果表明,Cd暴露可致ICR小鼠肝脏组织铁代谢紊乱,抗氧化水平降低,脂质过氧化,从而介导肝脏发生铁死亡。本研究为进一步完善Cd暴露致肝损伤的毒性机制提供了重要的理论依据。

镉通过Nrf2/HO-1通路诱导猪肾PK-15细胞铁死亡

镉(Cd)是非必需且难降解的重金属元素之一,镉蓄积可导致肾损伤。本研究旨在揭示镉暴露诱导猪肾PK-15细胞铁死亡的作用机制。首先,CCK-8法检测梯度浓度氯化镉(CdCl_(2))对PK-15细胞活力的影响,以筛选出合适的工作浓度。其次,用10μmol/L CdCl_(2)处理PK-15细胞3、6和12 h,通过比色法检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)和细胞中丙二醛(MDA)的含量,Western blot检测铁死亡相关蛋白的表达水平,荧光探针法检测细胞中亚铁离子(Fe^(2+))含量。最后,用10μmol/L的HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP)预处理PK-15细胞6 h,再用10μmol/L CdCl_(2)处理PK-15细胞12 h,通过相差显微镜观察细胞形态,Western blot检测铁死亡相关蛋白表达水平。结果显示,CdCl_(2)处理后细胞活力下降,LDH、MDA和Fe^(2+)水平极显著升高(P<0.01),Nrf2、HO-1和ALOX5蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),FTH1蛋白表达水平极显著下降(P<0.01)。与CdCl_(2)处理组相比,ZnPP可以显著改善CdCl_(2)处理诱导的猪肾PK-15细胞铁死亡。ZnPP预处理组细胞形态明显好转,Nrf2、HO-1和ALOX5蛋白表达水平极显著下降(P<0.01),FTH1蛋白表达水平极显著升高(P<0.01)。结果表明,镉通过Nrf2/HO-1通路引发细胞铁过载和脂质过氧化,诱导猪肾PK-15细胞铁死亡。

镉诱导大鼠肝细胞BRL-3A铁死亡及其作用机制

用4μmol/L氯化镉处理大鼠肝脏细胞BRL-3A 12,24,36 h后,通过CCK-8法测定细胞活力,比色法检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,流式细胞术检测细胞中活性氧(ROS)的含量及线粒体膜电位水平,比色法检测细胞中氧化还原相关指标丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的变化,Western blot检测铁死亡相关蛋白的表达,荧光探针法检测细胞中亚铁离子(Fe^(2+))的含量,电子显微镜观察细胞的超微结构。结果显示,镉(Cd)处理后,BRL-3A细胞活力下降,LDH水平显著升高;ROS、MDA、GSH、GSSG和Fe^(2+)含量极显著增加(P<0.01),FTH1、TfR1、HO-1蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),GPX4蛋白表达水平极显著下降(P<0.01),SLC7A11蛋白水平变化不显著,细胞线粒体萎缩变小、嵴减少或消失。结果表明,Cd处理可致BRL-3A细胞发生脂质过氧化物和Fe^(2+)的蓄积,GPX4水平下降,从而介导细胞发生铁死亡。

BVDV感染对小鼠巨噬细胞IFN-β相关信号分子的影响

为了探究致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhealvirus,BVDV)对小鼠巨噬细胞IFN-β相关信号分子的影响,以0.1和3 MOI感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-qPCR、Western blot、ELISA等方法检测小鼠巨噬细胞中TLR37/TLR7、IRF3/IRF7、STAT1、IFN-β、ISG15/OAS1和USP18/SOCS1等因子的转录和表达水平差异,并对巨噬细胞中BVDV拷贝数进行检测。结果显示BVDV可以进入巨噬细胞细胞内,但病毒拷贝数不能随时间而增长。BVDV进入小鼠巨噬细胞先后上调TLR3和下调TLR7的转录水平,继而显著上调IRF3和IRF7转录水平,并呈现一定的剂量依赖性。STAT1和IFN-β的转录和表达也随BVDV感染而显著升高,而且IFN-β表达量随BVDV的病毒量和感染时间而增加。发挥抗病毒活性的ISG15和OAS1转录水平在BVDV感染前期出现显著升高,感染后期恢复正常,同时在感染后期干扰素负性调节因子USP18和SOCS1转录水平显著升高。所以致细胞病变型BVDV可以感染小鼠巨噬细胞,但不能复制,但可以通过TLR3/7-IRF3/7激活IFN相关信号通路,并接受负性调节因子的调控。

镉胁迫下α-硫辛酸对大鼠肾细胞MAPK信号通路的影响

为了探究α-硫辛酸(α-LA)在镉(Cd)暴露的情况下对大鼠肾细胞MAPK通路的影响,以SD大鼠、大鼠肾小管上皮细胞系(NRK-52E)和大鼠原代肾小管上皮细胞(rPT)为试验模型,设置对照组、Cd暴露组、Cd+α-LA组以及α-LA组。采用透射电镜观察细胞超微结构的变化,用光学显微镜观察肾脏组织病理学的变化,通过Western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的相对表达水平。结果显示,与对照组相比,Cd暴露组多数细胞出现细胞核固缩、变形、染色质边聚甚至溶解,细胞内出现大量空泡;HE染色可见细胞变性、细胞管型、管壁变薄甚至破裂的现象;ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平显著或极显著升高。与Cd暴露组相比,Cd+α-LA组细胞核皱缩轻微,染色质分布相对均匀;肾小球毛细血管充血和肾小管变性明显改善;ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平显著或极显著降低。α-LA组与对照组相比无明显差异。结果表明,Cd暴露可诱导大鼠肾细胞损伤并激活MAPK信号通路,而α-LA通过抑制MAPK信号通路的活化缓解Cd诱导的细胞损伤。