2021年浙江省部分地区猪圆环病毒2型及3型的遗传变异分析

为了解2021年中国浙江省各地区猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,本研究采用PCR技术对不同地区来源的702份病料样品检测。选取10个PCV2阳性样品进行全基因序列扩增和同源性及遗传演化分析。同时对已测序的26个PCV2 ORF2基因和24个PCV3 ORF2基因分别进行同源性分析,以及对Cap蛋白氨基酸序列进行比对分析。结果显示,病料样品中PCV2的总阳性率为32.8%(230/702),PCV3的总阳性率为15.0%(105/702)。其中PCV2在血清样品中的检出率最高,而PCV3在粪便样品中的检出率较高。PCV2和PCV3混合感染血清阳性率为6.1%(33/539),且仅在血清样品中有混合感染。测序筛选后共获得6个PCV2全基因序列,其中5个全基因序列为1767 bp,1个为1708 bp。PCV2全基因序列与24个国内外PCV2参考株全基因序列相比,同源性为94.1%~98.9%。通过全基因遗传进化树显示,6个PCV2全基因有5个PCV2d亚型和1个PCV2b亚型。ORF2基因序列的同源性结果显示,PCV2与PCV2疫苗株的同源性为90.2%~95.3%;PCV3与PCV3参考株的同源性为99.2%~99.4%,与PCV2疫苗株的同源性仅为32%,可能影响PCV2疫苗的保护效力。通过ORF2编码的Cap蛋白氨基酸序列比对结果显示,本研究中的PCV2 Cap蛋白氨基酸序列有20处变异,其中R^(59)K、K^(63)R、A^(68)N、R^(89)L、S^(90)T、S^(121)T、T^(134)N、S^(169)R、E^(210)D的变异揭示了该地区PCV2b亚型正逐渐向PCV2d亚型转变。上述结果表明,浙江省部分地区的PCV2d亚型已成为主要的流行基因型,且PCV3与PCV2疫苗株同源性较低。本研究结果丰富了浙江省PCV的分子流行病学资料,为相应疫病的防控提供一定的参考依据。

AIM2炎症复合体活化体系的体外构建及初步应用

AIM2炎症复合体参与自身免疫性疾病和机体抵御病原体的过程,研究其激活机制具有重要的意义。为构建AIM2炎症复合体的体外活化体系,本研究通过PCR方法从人单核细胞(THP-1细胞)中扩增AIM2、ASC、pro-Caspase-1、pro-IL-1β基因片段后,构建重组质粒p3×Flag-AIM2、p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1和p3×Flag-pro-IL-1β,分别转染HEK293T细胞后采用western blot鉴定各蛋白的表达。结果显示,分别约在41.9 ku、34.1 ku、48.5 ku、24.6 ku处出现特异性条带,表明融合Flag标签的AIM2、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白在HEK293T细胞中获得了表达。除此之外,还可以在HEK293T细胞中检测到39 ku的内源性AIM2蛋白特异性条带,表明HEK293T细胞自身也表达内源性AIM2蛋白。将不同浓度比例的上述重组质粒转染或共转染HEK293T细胞,24 h后各组再转染poly(dA:dT),采用间接ELISA检测各组细胞中IL-1β的分泌水平。结果显示,空白对照组、p3×Flag-pro-IL-1β实验组和共转染p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-IL-1β实验组细胞上清中均未检测到IL-1β,共转染p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1、p3×Flag-pro-IL-1β和共转染p3×Flag-AIM2、p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1、p3×Flag-pro-IL-1β的实验组细胞上清中均能检测到高浓度的IL-1β,且共转染p3×Flag-AIM2的HEK293T细胞中IL-1β的分泌水平更高。此外,与对照组相比,poly(dA:dT)刺激后的各组HEK293T细胞中IL-1β的分泌水平极显著升高(P<0.001),表明AIM2炎症复合体的体外活化体系正确构建。将不同浓度的p3×Flag-AIM2与其它质粒共转染HEK293T细胞,并转染poly(dA:dT)作用,采用间接ELISA检测IL-1β的分泌水平,结果显示,无论是否转染poly(dA:dT),随着p3×Flag-AIM2的转染剂量的升高,IL-1β的分泌水平也显著或极显著升高(P<0.001、P<0.01、P<0.05、P<0.001),表明细胞中AIM2蛋白的表达量与AIM2炎症复合体的活性呈正相关。单核细胞增生性李斯特菌已被证实可以激活AIM2炎症复合体,利用该菌感染上述炎症复合体活化体系,6 h后采用LDH试剂盒检测各组细胞胞内细菌的存活情况。结果显示,细胞内单核细胞增生性李斯特菌的数量在感染2 h和6 h极显著低于不转染质粒的对照组(P<0.001、P<0.01),表明构建的AIM2炎症复合体活化体系发挥了抗细菌感染的作用。综上所述,本研究正确构建了AIM2炎症复合体活化体系,并初步通过该活化体系证实AIM2炎症复合体具有抗细菌感染的功能,为后续研究该活化体系的具体作用机制奠定了基础。

肺炎克雷伯菌疫苗研究进展

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一种常见的人兽共患条件致病菌,在全世界流行,危害性逐年增加,严重威胁养殖业健康发展和公共卫生安全。目前临床控制该菌感染主要依赖抗菌药物治疗,而肺炎克雷伯菌耐药性增强导致当前对该菌的防治面临巨大挑战,需要寻找新的防治方法。疫苗接种为预防细菌感染的主要候选措施,因此亟需有效控制肺炎克雷伯菌的疫苗。近年来,继传统灭活苗后,新型减毒活疫苗、亚单位疫苗和重组疫苗、核酸疫苗和纳米疫苗等已开展研究,但目前暂无商品化的肺炎克雷伯菌疫苗问世。论文对肺炎克雷伯菌疫苗的研究进展做一综述,为肺炎克雷伯菌疫苗的深入研究及产品开发提供参考。

禽致病性大肠杆菌fdtACB基因缺失株的生物学特性研究

为研究O抗原侧链岩藻糖合成酶基因fdtACB对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究以O_(2)血清型APEC DE17为亲本株,通过Red同源重组构建fdtACB基因缺失株与回补株,经PCR及测序鉴定确认缺失株ΔfdtACB和回补株CΔfdtACB均正确构建。采用硝酸银染色法鉴定细菌脂多糖(LPS)图谱,采用western blot鉴定缺失株与O_(2)血清型O因子血清的反应性。硝酸银染色法结果显示,ΔfdtACB缺失株未产生与野生株一样完整的LPS图谱,表现为部分O抗原梯状条带缺失和移位;western blot结果显示,ΔfdtACB与大肠杆菌O_(2)血清型O因子血清无反应条带。各菌株培养16 h后每隔1 h测定OD600nm值,绘制生长曲线;于半固体培养基培养各菌株,通过测量细菌运动圈直径分析各菌株的运动能力,通过结晶紫染色法检测各菌株生物被膜(BF)形成能力,结果显示,ΔfdtACB缺失株、野生株和回补株间生长速率无明显差异(P>0.05);与野生株相比,ΔfdtACB缺失株的运动能力显著降低(P<0.01),BF形成能力显著升高(P<0.01)。以上结果表明fdtACB影响细菌O抗原完整性、运动及BF的形成。将各菌株分别感染DF-1细胞后通过细菌计数分析APEC对细胞的黏附及侵袭力,结果显示,ΔfdtACB对DF-1细胞的黏附及侵袭力均较野生株极显著降低(P<0.01)。以不同浓度各菌株腹腔注射感染大蜡螟后,根据5 d内各组大蜡螟死亡数量计算各菌株LD50,结果显示,除高剂量各菌株外,其它剂量各菌株注射后,ΔfdtACB组大蜡螟死亡数较其它组少,经计算野生株LD50为1.85×10^(2) cfu/mL,缺失株LD50为9.16×10^(2) cfu/mL,回补株LD50为8.0×10^(1) cfu/mL,缺失株致病力比野生株降低约5倍,表明fdtACB影响细菌感染性和致病力。综上所述,本研究首次证实大肠杆菌岩藻糖合成酶FdtACB参与O_(2)型APEC O的抗原合成,在细菌运动、BF形成和感染过程中发挥作用,该结果对掌握APEC O抗原侧链的生物学功能具有重要意义。

单增李斯特菌感染并调控宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)的研究

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)表达的相互影响机制,本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染HeLa细胞5 h后,利用qRT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化,结果显示LM-EGD-e感染HeLa细胞中Pcca基因的转录水平无明显变化(log2FC=-0.305);采用相应试剂盒分别提取感染后的HeLa细胞蛋白和线粒体蛋白,采用western blot检测PCCA蛋白表达变化,结果显示,LM-EGD-e感染后的HeLa细胞中,以及线粒体中PCCA蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。PCR扩增Pcca基因后构建pCMV-N-HA-PCCA重组质粒,并经PCR和测序鉴定正确后转染HeLa细胞中过表达PCCA蛋白后,利用qRT-PCR检测HeLa细胞中Pcca基因的转录水平,收集细胞总蛋白采用western blot检测PCCA蛋白表达水平,结果显示,与转染空载体的细胞相比,转染重组质粒的HeLa细胞中Pcca基因的转录水平上调(log2FC=8.454),且细胞内PCCA蛋白表达量显著增加(P<0.001)。利用LM-EGD-e以MOI 200感染过表达PCCA蛋白的HeLa细胞,在感染后2 h、5 h和8 h分别收集感染细胞进行点样计数,结果显示,感染后各时间点PCCA蛋白过表达显著或极显著抑制LM-EGD-e的感染及其在胞内增殖的能力(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。综上所述,单增李斯特菌感染对宿主细胞内PCCA蛋白的表达无显著影响,但在宿主细胞中过表达PCCA会降低单增李斯特菌的胞内增殖能力。本研究首次探究了单增李斯特菌与宿主PCCA蛋白的调控关系,为深入探究单增李斯特菌等重要胞内菌的感染与宿主的内在联系机制,以及防控该病原感染奠定了基础。

单增李斯特菌谷氧还蛋白调控氧化应激相关基因转录的研究

本实验室前期对单增李斯特菌(LM)谷氧还蛋白(Grx)转录组数据进行了分析,在此基础上为了对Grx调控细胞色素氧化酶等应激相关基因(lmo0722、qox A、qox B、gr)的转录及其作用机制研究,本研究将Δgrx与野生株EGD-e经4 mmol/L肼应激后,分别提取总RNA并反转录为cDNA作为模板,利用RT-q PCR检测Grx调控细胞色素氧化酶等应激相关基因转录情况,结果显示,Δgrx与野生株EGD-e相比,grx基因缺失引起qox B、qox A、gr、lmo0722等基因的转录水平显著上调(分别上调30、29、17和5.6倍)。利用李斯特菌穿梭质粒构建携带调控基因启动子序列的gfp报告质粒,电转化至野生株EGD-e和缺失株Δgrx感受态细胞中,获得含GFP的重组报告菌株。将这两种含GFP的重组报告菌液分别加入4 mmol/L肼后检测荧光强度,结果显示,EGD-e携带的GFP荧光数值显著低于缺失株Δgrx(P<0.01),进一步表明Grx参与调控上述应激相关基因的转录。将扩增的lmo0722、qox A、qox B和gr基因的启动子和Grx、Prf A和GAPDH重组蛋白混合,37℃孵育60 min后进行凝胶迁移试验(EMSA),结果显示,Grx和上述调控基因启动子不直接结合,提示Grx可能通过间接方式参与该调控过程。本研究首次证实LM Grx通过对氧化应激相关基因的转录调控进而在细菌抗氧化应激环境适应过程中发挥重要作用,为系统阐述重要食源性病原菌在环境适应中发挥作用的调控机制提供了科学参考。

牛病毒性腹泻病毒核心蛋白C激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的分子机制研究

为探究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的分子机制。本研究构建BVDV C蛋白真核表达质粒pCMV-C,经PCR和测序鉴定正确后转染牛睾丸原代(BT)细胞,48 h采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测C蛋白的表达;采用CCK-8法检测转染pCMV-C(过表达C蛋白)的BT细胞活性。结果显示,该BT细胞出现特异性绿色荧光,且在23 ku处出现特异性条带,阴性对照细胞(转染pCMV的细胞,后同)未见绿色荧光也无该条带,表明C蛋白在BT细胞中获得了表达。细胞活性检测结果显示,过表达C蛋白的BT细胞活性极显著低于阴性对照组细胞(P<0.001)。将荧光素酶报告质粒pNF-κB-Luc、内参质粒pRL-TK和pCMV-C共转染BT细胞,并设置相应的阳性和阴性对照,48 h后采用双荧光素酶报告系统检测各组细胞上清中NF-κB的相对荧光素酶活性。结果显示,共转染3种质粒的BT细胞及阳性对照细胞中NF-κB相对荧光素酶活性极显著高于空白对照组和阴性对照组(共转染pCMV、pNF-κB-Luc和pRL-TK的细胞)(P<0.01)。通过荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分别检测过表达C蛋白的BT细胞中NLRP3炎症小体组分[Caspase-1前体(pro-Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、NLRP3及IL-1β的前体(pro-IL-1β)]mRNA的转录水平;采用western blot检测该BT细胞中NLRP3炎症小体组分(pro-Caspas-1、ASC、NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的表达水平并通过western blot分析pro-Caspase-1和pro IL-1β的切割结果。结果显示,过表达C蛋白的BT细胞中NLRP3和ASC mRNA转录水平(P<0.01)、pro-Caspase-1和pro-IL-1βmRNA转录水平(P<0.001)均极显著高于阴性对照组细胞;该BT细胞中NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1P20、ASC、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平均明显高于阴性对照组细胞。转录和蛋白表达水平均表明BT细胞发生了炎症反应,且pro-Caspase-1被切割成为有活性的Caspase-1和Caspase-1p20,pro-IL-1β被切割成有活性的IL-1β。将pCMV-C和pCMV-ASC、pCMV-C和pCMV-NLRP3分别共转染293T细胞,48 h后通过激光共聚焦显微镜观察C蛋白与NLRP3和ASC的共定位。结果显示,C蛋白分别与NLRP3和ASC在细胞质中存在共定位。为进一步探究C蛋白激活NLRP3炎症小体对细胞焦亡的影响,通过qRT-PCR和western blot检测过表达C蛋白的BT细胞中死亡调节蛋白GSDMD mRNA的转录、蛋白表达水平及切割情况。通过扫描电镜观察转染pCMV-C 12 h和24 h的BT细胞,并采用间接ELISA检测转染pCMV-C 24 h BT细胞上清中IL-1β的含量。qRT-PCR结果显示,GSDMD mRNA转录水平极显著高于空白对照组和阴性对照组细胞(P<0.001);GSDMD蛋白的表达水平也明显高于两个对照组,且该蛋白被切割成有活性的GSDMD-N和GSDMD-C。电镜观察结果显示,与阴性对照细胞相比,随着C蛋白表达时间的延长,BT细胞膜逐渐破裂,细胞膜均已形成渗透孔,并有细胞内容物的释放,且细胞上清中IL-1β的含量极显著高于阴性对照组细胞(P<0.01)。上述研究表明,C蛋白能够显著引起NLRP3炎症小体活化进而激活pro-Caspase-1形成活化的Caspase-1,后者一方面切割GSDMD,形成有活性的GSDMD-N,并在BT细胞膜形成孔洞,释放内容物,诱导BT细胞发生细胞焦亡,另一方面活化的Caspase-1切割pro-IL-1β,形成有活性的IL-1β,并释放到BT细胞外,致细胞上清中IL-1β含量极显著升高。本研究为进一步阐明BVDV的致病机制以及制定BVD的防控策略提供参考。

单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究

为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。

重组耻垢分枝杆菌MS_PE16的构建及其生物学特性研究

为探究牛分枝杆菌(M.bovis)PE/PPE家族成员PE16蛋白的生物学功能,本研究以M.bovis基因组DNA为模板扩增PE16基因片段并克隆至pMN437载体中,构建原核表达质粒pMN437-PE16,经PCR和测序鉴定正确后将该重组质粒及对照质粒PMS2电转入耻垢分枝杆菌中构建重组耻垢分枝杆菌MS_PE16及对照重组耻垢分枝杆菌MS_Vec。经western blot鉴定结果显示,重组耻垢分枝杆菌中PE16在55 ku左右正确表达,而MS_Vec则无该特异性条带。对MS_PE16及MS_Vec进行生长曲线测定,并利用倒置显微镜观察MS_PE16及MS_Vec的菌落形态;将培养至对数生长期的MS_PE16及MS_Vec分别以MOI 10感染人白血病单核细胞(THP-1细胞),感染后0(感染4 h后经庆大霉素处理2 h,此时计为0)、24 h、48 h时采用平板计数法检测胞内菌数量;细菌感染后24 h和48 h时收集各组细胞培养上清,利用ELISA试剂盒检测各组细胞IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-β的表达分泌水平。生长曲线测定结果显示,PE16对分枝杆菌的生长无显著影响;菌落形态观察结果显示,MS_PE16与MS_Vec的菌落形态无明显区别;胞内活菌数量检测结果显示,细菌感染后0和24 h,MS_PE16在THP-1细胞中的数量极显著低于MS_Vec(P<0.01),但在感染后48 h,MS_PE16在THP-1细胞中的存活率极显著高于MS_Vec组在THP-1细胞中的存活率(P<0.001);细胞因子检测结果显示,MS_PE16感染组细胞中IFN-β的分泌水平极显著高于MS_Vec组(P<0.01)。上述结果表明PE16对分枝杆菌的生长和菌落形态均无显著影响,但其可提高分枝杆菌在巨噬细胞内的存活率,且可促进巨噬细胞中IFN-β的分泌水平。本研究初步揭示了分枝杆菌PE16蛋白的功能,为M.bovis感染机制的进一步研究提供了实验数据。

大肠杆菌P88噬菌体gp52和gp53基因对其裂解活性和宿主谱形成影响的研究

为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融合p ST98-AS质粒的四环素抗性基因和I-Sce I核酸内切酶基因,构建缺失质粒p WRG99。利用质粒p WRG99分别构建大肠杆菌K88的gp52和gp53基因缺失突变株(Δgp52和Δgp53)并经PCR和测序鉴定。利用丝裂霉素C诱导Δgp52和Δgp53,采用双层平板法检测噬菌体的裂解活性,结果显示,Δgp52和Δgp53的诱导液可以在大肠杆菌DE048为宿主菌的平皿上形成清晰的噬菌斑,表明Δgp52和Δgp53能诱导出可以感染DE048的噬菌体(将该噬菌体命名为P88-52和P88-53),并且gp52和gp53基因缺失均不影响噬菌体P88的形成和裂解活性。将P88-52和P88-53纯化并经电镜观察,结果显示,P88-52和P88-53与野生株P88形态相似,具有P2-like噬菌体典型的肌尾和短尾丝特征,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体颗粒的形态。利用P88的宿主菌对P88-52和P88-53进行宿主谱分析,结果显示,P88-52和P88-53在DE048为宿主菌的平皿上均可以形成清晰的噬菌斑,在MC1061、DH5α和BL21为宿主菌的平皿上均不能形成噬菌斑,与噬菌体P88宿主谱相同,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体的宿主谱。综上所述,在宿主菌K88基因组的基础上缺失gp52和gp53基因后,诱导出的P88突变噬菌体的裂解活性和宿主谱均不受影响。本研究通过在宿主菌中对前噬菌体基因编辑来研究溶原性噬菌体的基因功能,为其他溶原性噬菌体基因功能的研究提供了参考依据。

两种启动子拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒ZJ-JX-2015株效率的比较研究

为比较不同启动子驱动的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强毒株ZJ-JX-2015感染性克隆拯救的各重组病毒的效率,本研究将ZJ-JX-2015株全基因组引入无义突变位点(C-G,形成Bst B I酶切位点)作为后期鉴定标签并分成4段经PCR扩增后,分别克隆至含CMV启动子的p SMART-BAC载体和含T7启动子的p WSK-29载体中构建感染性克隆质粒p SMART-BAC-CMV-r PRRSV和p WSK-29-T7-r PRRSV,经PCR及测序鉴定正确后将前者分别转染BHK-21和293T细胞;将后者转染BHK-21(T7)细胞。48 h后收集上述各细胞上清液接种Marc-145细胞并连续传10代。通过观察细胞病变(CPE),收集不同代次Marc-145细胞上清液经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定拯救的各重组病毒。将拯救的各重组病毒以MOI 0.1接种Marc-145细胞,通过测定不同时间各病毒上清液的病毒效价(TCID50)绘制生长曲线。结果显示,各细胞上清液[BHK-21、293T细胞及BHK-21细胞(T7)]在Marc-145细胞中传至第2代时均出现CPE;PCR及测序鉴定结果显示,各代次的各组Marc-145细胞上清液均能扩增到544 bp的目的片段,且均含遗传标记Bst B I酶切位点。IFA结果显示,上述各代次各组Marc-145细胞上清液接种的各细胞中均出现绿色荧光,对照Marc-145细胞无绿色荧光。上述结果表明,拯救了3株重组PRRSV:BHK-r JX15、293T-r JX15(分别转染BHK21及293T细胞所得)及T7-r JX15株[转染BHK-21(T7)细胞所得],且各病毒的遗传稳定性较强。测定各病毒TCID50并绘制各病毒生长曲线,结果显示,在各病毒的感染后期(感染后72 h),BHK-r JX15株的病毒效价显著高于亲本病毒(P<0.05),极显著高于T7-r JX15及293T-r JX15株(P<0.01);293T-r JX15的病毒效价极显著高于T7-r JX15株(P<0.01),但这两株病毒的效价又极显著低于亲本病毒(P<0.001)。且4株病毒的生长趋势基本一致。上述结果表明CMV启动子驱动的重组PRRSV(BHK-rJX15和293T-r JX15)复制水平高于T7启动子驱动的重组病毒(T7-rJX15),尤以CMV启动子驱动并通过BHK细胞拯救的重组病毒(BHK-rJX15)复制水平最高。提示,CMV启动子更适用于构建PRRSV的反向遗传操作系统。本研究为构建PRRSV反向遗传操作系统及其蛋白功能研究、新型疫苗的研发奠定了基础。

基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫MIC3抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估

本实验室前期构建的基于毒力基因改造的减毒单增李斯特菌(LM-1)被证实是一种较为安全的疫苗载体。为构建表达鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)毒力蛋白MIC3的重组减毒单增李斯特菌(LM)疫苗候选株并评估其对雏鸡的免疫保护效果,本研究在LM-1基础上采用同源重组的方法将MIC3蛋白关键功能区(aa159~aa252)编码基因(475 bp~756 bp)定点整合至LM-1基因组中,并与LM溶血素O(LLO,其编码基因为Rly)融合表达获得重组LM-1-MIC3菌株并经PCR鉴定;western blot检测LM-1-MIC3中MIC3和LLO的表达;测定细菌体外生长曲线检测LM-1-MIC3的体外生长能力;将野生菌株EGO-e、LM-1、LM-1-MIC3分别感染雏鸡72 h和144 h后,分别剖杀,取各组雏鸡肝脏和脾脏,经菌落计数对雏鸡肝脾载菌量进行测定并评估LM-1-MIC3在雏鸡体内的增殖能力;将野生株EGD-e、LM-1和LM-1-MIC3感染雏鸡并结合临床症状及致死率评估LM-1-MIC3对雏鸡的安全性;将LM-1-MIC3免疫雏鸡并建立E.tenella感染模型,研究其对雏鸡抗球虫感染的免疫保护效果。PCR鉴定结果显示正确构建重组菌株LM-1-MIC3;western blot结果显示LM-1-MIC3分泌的融合蛋白LLO-MIC3能够在培养上清液中大量表达;细菌体外培养结果显示LM-1-MIC3体外生长能力与EGD-e和LM-1无显著差异,表明融合LLO的MIC3不会影响LM-1的生长;雏鸡肝脾载菌量测定结果显示,与EGD-e组相比,各时间段LM-1-MIC3组雏鸡肝脾载菌量均极显著降低(P<0.01),感染LM-1-MIC3后雏鸡均存活且无明显临床症状,表明LM-1-MIC3对雏鸡致病力高度减弱,可以作为减毒疫苗载体;免疫保护试验结果显示在攻虫10 d后,LM-1-MIC3免疫组雏鸡的存活率高于LM-1免疫组及PBS对照组,且该组鸡无明显临床症状,剖杀后盲肠病变评分极显著低于LM-1和PBS组(P<0.001),表明LM-1-MIC3对雏鸡有良好的免疫保护效果。本研究构建了重组减毒株LM-1-MIC3,并证实该重组菌对雏鸡具有较好的免疫保护效果,为减毒LM载体疫苗在防控重要动物传染病中的研究与应用奠定了科学基础。

N-乙酰半胱氨酸对双酚A诱导的猪肾细胞凋亡和炎症反应的抑制作用

【背景】双酚A(BPA)广泛应用于塑料材料工业制造,其从塑料制品中渗出,暴露在食物、水、土壤和空气等多种环境介质中,导致动物长期接触,并经过胎盘和母乳传递给后代,干扰动物生长和发育,对动物生长性能和生产效率产生不利影响。N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为公认的强效抗氧化剂,能够调节氧化应激、细胞凋亡、炎症等多种病理生理过程。然而,NAC对BPA诱导的猪肾细胞损伤的调节作用尚不清楚。【目的】探究抗氧化剂NAC在BPA诱导的PK15细胞凋亡和炎症反应中的潜在作用,为NAC在对抗BPA诱导的猪肾细胞损伤中的应用研究提供科学依据。【方法】选取PK15细胞为试验材料,采用相应的抗氧化检测试剂盒分别测定细胞内过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性变化;设置不同浓度NAC(0、2、5和10 mmol·L^(-1))预处理,并与BPA共处理PK15细胞,CCK-8检测细胞活力以筛选最佳的NAC作用浓度;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测凋亡相关基因(BAX、BCL-2和Caspase3)表达和炎症相关基因(IL-8、IL-6、IL-1β和TNF-α)mRNA相对表达量,蛋白免疫印迹检测凋亡相关蛋白(BAX、BCL-2、cleaved-Caspase3)水平;免疫荧光染色检测凋亡细胞数量和核因子κB(NF-κB)核易位。【结果】与对照组相比,BPA处理显著降低了细胞内CAT、T-SOD和GSH-Px活性(P<0.05)。CCK-8结果显示,与对照组相比,BPA显著降低PK15细胞活力,而不同浓度的NAC均能显著促进PK15细胞活力(P<0.05),且与BPA单独处理相比,5和10 mmol·L^(-1)NAC预处理均能显著促进PK15细胞活力(P<0.05);qRT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示,BPA处理显著增加了BAX、Caspase3 mRNA相对表达量以及蛋白表达水平,减少了BCL-2 mRNA相对表达量和蛋白表达(P<0.05),而NAC预处理能够减少BPA诱导增加的BAX、Caspase3基因和蛋白表达,增加BCL-2基因和蛋白表达;Hoechst 33258荧光染色显示,BPA处理的细胞呈现强蓝色荧光染色且有明显的核皱缩,而NAC预处理后呈现较弱的蓝色荧光;BPA处理显著增加炎症相关因子(IL-8和IL-6)mRNA相对表达量(P<0.05),而NAC预处理抑制BPA诱导增加的炎症相关因子(IL-8、IL-6和IL-1β)mRNA相对表达量,免疫荧光检测NF-κB核易位显示,对照组的NF-κB主要分布在细胞质中,而BPA处理后的NF-κB主要分布在细胞核,NAC预处理明显减少核NF-κB的表达。【结论】NAC显著提高BPA诱导降低的PK15细胞活力,抑制BPA诱导的PK15细胞凋亡和炎症反应。

1株朱鹮源红斑丹毒丝菌的分离鉴定及生物学特征分析

为确定浙江省德清县朱鹮抢救保护基地一只死亡朱鹮的发病原因及病原特征,本研究采集其肝脏、心脏等组织样品,通过TSA平板划线培养,观察菌落、革兰氏染色、生化鉴定和16S rRNA基因的PCR扩增与序列分析。结果显示,从朱鹮体内分离的细菌为红斑丹毒丝菌(E.rhusiopathiae),并命名为E.rhusiopathiae-716株。采用纸片扩散(K-B)法检测该菌对8类10种药物的敏感性;采用微量结晶紫染色法鉴定分离菌的生物被膜(BF)形成能力,结果显示该菌对青霉素类的氨苄西林和青霉素、喹诺酮类的诺氟沙星等5类6种抗生素敏感,对四环素类的四环素、大环内酯类的红霉素、氨基糖苷类的庆大霉素和阿米卡星等3类4种抗生素耐药,且其BF形成能力适中。采用Illumina二代测序平台对分离菌的全基因组测序,并采用SPAdes拼接序列;利用Prokka和PATRIC 3.6.9分析该菌基因组的分子特征。利用CARD数据库预测分离菌的耐药基因;采用VFDB数据库预测分离菌的毒力基因。采用ParSNP软件绘制该分离菌与GenBank中不同国家不同宿主来源的红斑丹毒丝菌全基因组的系统发育树。全基因组的分子特征分析结果显示,该分离菌基因组全长1.78×10^(3)kb,GC含量36.5%,含1694个蛋白编码基因、55个tRNA、6个rRNA、1个tmRNA,无质粒、无前噬菌体。经软件预测结果显示,该分离菌携带3个耐药基因,分别是耐四环素类药物的tetM、耐大环内酯类药物的mefA及兼具大环内酯类、林可酰胺类以及原霉素B类的msrD基因,这与其对四环素、红霉素的耐药表型相符,但未携带庆大霉素和阿米卡星耐药相关基因;其携带76个与菌毛、荚膜、铁摄取、溶胞素、分泌、转运等毒力相关基因;系统发育树结果显示分离株E.rhusiopathiae-716与韩国海豚源红斑丹毒丝菌分离株KC-Sb-R1处于同一分支,进一步表明分离菌为红斑丹毒丝菌。将不同剂量的E.rhusiopathiae-716株分别经腹腔感染雏鸭及小鼠后在7 d观察期内评估其致病性。结果显示,中高剂量组(1×10^(5)cfu/mL~1×10^(8)cfu/mL)雏鸭和小鼠均出现厌食,被毛杂乱现象,部分雏鸭久卧不起,低剂量(1×10^(4)cfu/mL)组及阴性对照组雏鸭和小鼠均无明显异常。经计算,该分离菌对雏鸭和小鼠的LD50分别为1×10^(4.94)cfu/mL和1×10^(5.86)cfu/mL;病死鸭及小鼠剖检后观察到二者消化道有出血点,雏鸭气囊浑浊等剖检病变,并再次从这两种动物的肝脏中分离到该菌。上述结果表明该菌株对禽类和哺乳动物均具有潜在致病性。本研究首次分离鉴定到一株朱鹮源致病性红斑丹毒丝菌,并证实该菌为朱鹮的致病菌,该结果为进一步研究红斑丹毒丝菌的致病机制及朱鹮相关疾病的防治提供了用药参考。

3C样蛋白酶:重要抗PEDV药物的筛选靶标

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)成员。由于冠状病毒的RNA酶缺乏校正功能,PEDV等冠状病毒的基因组易发生变异。

一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治

2021年5月,浙江诸暨某中华鳖养殖场中华鳖脖子肿胀、伸长,底板出现多处血点,并伴随大量死亡,经解剖可见腮部糜烂、充血明显,内脏呈现不同程度病变。从病鳖腮、肝、脾、肾、肠等组织分离纯化病原菌,经形态观察、生化鉴定确定其种属,并采用微量肉汤连续稀释法确定8种国标渔药对其最低抑菌浓度;同时,利用PCR方法检验是否存在病毒感染。结果显示:自有典型临床症状的中华鳖组织中分离到嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明,该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素3种抗菌药物敏感。同时,在患病中华鳖内脏中检测到一种病毒,通过测序与构建系统进化树发现该病毒与中华鳖出血性综合征病毒同源性最高且聚为一支。病原回归感染试验结果表明,分离的嗜水气单胞菌与病毒均可引起中华鳖不同程度死亡。该例中华鳖腮腺炎为嗜水气单胞菌与出血性综合征病毒混合感染所致。该研究可为中华鳖腮腺炎的科学诊断与防控提供理论依据。

猪星状病毒(PAstV)在中国流行的研究进展

猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)是一种无包膜的、单股正链RNA病毒,存在5种基因型,是一种常见的猪肠道传染病病毒。PAstV广泛流行于我国猪群中,常与其他猪肠道病原混合感染而引起腹泻,给我国养猪业带来了严重的经济损失。本文综述了PAstV在我国2006年~2021年间猪群中的流行情况,系统分析了PAstV在不同年份的阳性率、各省份地区分布情况、与不同猪肠道病原的混合感染情况以及不同基因型的流行特点,为掌握我国PAstV流行情况以及病毒防控提供重要参考。

2020年~2021年我国副猪嗜血杆菌和链球菌的血清型、耐药基因型流行情况分析

为了解我国副猪嗜血杆菌(HPS)和猪链球菌(SS)血清型的流行趋势,本研究利用PCR对2020年~2021年国内分离的52株HPS和69株SS分别检测二者的血清型;通过查阅2014年~2020年国内外文献报道的402株HPS和189株SS的血清型,并与上述分离的HPS、SS的血清型作比较,分析二者血清型的流行趋势。结果显示,2020年~2021年HPS主要优势血清型占比由高到低依次为12>4=5>13型,SS主要优势血清型占比由高到低依次为2或1/2>5>不确定型(US)>8=18>27>15型;文献检索结果显示:2014年~2020年HPS主要优势血清型占比从高到低依次为4>5>US>13>14>7型,SS主要优势血清型为2或1/2>7>9>US。表明血清4、5、13型仍是HPS的优势血清型,且12型升高了28%;血清2或1/2仍然是我国SS的优势血清型,且5、15、18、27型明显增加,7和9型减少,US型仍然较高。采用K-B法检测HPS与SS分离株的耐药性,采用PCR检测二者的耐药基因(7大类共27种耐药基因),并分析二者的耐药基因与耐药表型的相关性。药敏试验结果显示,两类分离菌中对β-内酰胺类、大环内酯类和磺胺类药物耐药的菌株高达88.31%(68/77),对氨基糖苷类和四环素类药物耐药的菌株分别约为80.52%(62/77)和76.62%(59/77),对酰胺醇类和喹诺酮类药物耐药的菌株较少。且二者均存在严重的多重耐药性,其中双重耐药的菌株占比最高为28.57%(22/77),4重、5重、6重及8重耐药的菌株均为14.29%(11/77)。耐药基因检测结果显示,两类细菌均检出了β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类和Ⅰ类整合子4大类耐药基因,特别是β-内酰胺类的bla-TEM、磺胺类的sulI耐药基因检出率均为100%。其中100%HPS分离株检出氨基糖苷类的Aph(3’)-Ia、Ⅰ类整合子的3’CS和Int1耐药基因;100%SS分离株检出Ⅰ类整合子的VR耐药基因。两株菌耐药基因与耐药表型相关性分析结果显示,β-内酰胺类和磺胺类耐药表型与耐药基因之间的符合率达88%;氨基糖苷类耐药表型与耐药基因之间的符合率为72%;四环素类和喹诺酮类耐药基因和耐药表型之间不符合。上述结果表明,HPS和SS分离株的耐药性均较强,且其部分耐药表型与其携带的耐药基因相关性较强。本研究为规模化养殖场HPS和SS感染的临床用药及疫苗研发提供了数据支持,并为后续相关疾病的防控奠定了基础。

竹叶黄酮对敌草快应激大鼠肝脏损伤、抗氧化功能及相关基因表达的影响

旨在以大鼠为模型,研究竹叶黄酮(Bamboo leaf flavonoids,BLF)对敌草快(Diquat,DQ)应激动物肝脏损伤、抗氧化功能及相关基因表达的影响。选取32只5周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,将其随机分为4组:对照组(Con)、1000mg/kg竹叶黄酮添加组(BLF)、DQ应激组(DQ)、1000mg/kg竹叶黄酮+DQ应激组(BLF-DQ)。结果显示,与Con组相比,DQ组大鼠血清谷草转氨酶(AST)的含量显著降低(P<0.05),肝脏总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平显著减少(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05)。同时,肝脏血红素氧合酶-1(HO-1)、GPX、CAT、SOD1和核因子E2相关因子(Nrf2)的基因表达量显著降低(P<0.05);灌胃1000mg/kg BLF组大鼠血清AST和谷丙转氨酶(ALT)含量显著降低(P<0.05),肝脏T-AOC、GPX、CAT和SOD水平显著增强(P<0.05),肝脏HO-1、GPX、CAT、SOD1、Nrf2和醌氧化还原酶1(NQO1)基因表达水平显著上调(P<0.05);与DQ组相比,灌胃1000mg/kg BLF大鼠肝脏指数显著降低(P<0.05),血清中AST和ALT含量显著减少(P<0.05),同时肝脏中CAT、GPX、T-AOC水平显著增加(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05),肝脏HO-1、GPX、CAT、SOD1和Nrf2的基因表达量显著上调(P<0.05)。结果表明,BLF能够缓解DQ应激引起的大鼠肝脏损伤,改善肝脏抗氧化功能抑制状态,激活Nrf2信号通路和PINK/Parkin线粒体自噬相关基因表达。