浙江农林大学动物学科杨仙玉课题组简介

浙江农林大学动物学科杨仙玉课题组目前主要从事纤毛虫发育学和蟾酥多肽类有效成分基因克隆两方面研究：以尾草履虫（Paramecium caudatum）为模式生物,重点研究核发育的详细过程,并借助分子生物学技术手段探讨其调控机制;已开展对蟾蜍皮肤cDNA质粒文库的筛选工作,克隆到多个与癌症的发生、转移等相关基因，正在进行重组蛋白表达及生理功能检测工作。

浙江省不同森林类型林分健康指标体系

为了对浙江省森林健康状况进行快速、有效的评价,以浙江省不同森林类型(松林、阔叶林、针阔混交林和毛竹林)林分健康为切入点,选择代表林分质量、林分功能及林分抗逆性等15个指标,利用层次分析法构建林分健康评价指标体系,计算林分健康指数,并分别对不同林分的健康状况进行了分析。结果表明,各林分健康指数大小依次为针阔混交林、阔叶林、松林、毛竹林。

竹子基因资源和应用技术研究进展

竹子是世界和我国最重要的经济林木树种之一,具有重要的经济和生态价值。竹子种质资源的提升是竹产业发展的重大需求。随着分子生物学研究的不断进步,特别是竹子基因组的解析和遗传转化体系的建立,使得人们利用现代生物学技术提升竹子种质逐渐成为可能。笔者详细综述了近年来竹子研究的进展,包括竹子基因组的解析过程、调节竹子生长发育关键基因的挖掘,以及竹子再生和遗传转化体系的建立等。最后,对遗传转化新技术在竹子中的应用进行了展望。笔者系统地对目前竹子研究发掘的关键基因和关键技术进行了整理汇总,为今后竹子种质创新研究提供参考。

桃枝枯病病原菌鉴定及品种(种质)室内抗病性评价

【目的】明确桃枝枯病的病原菌以及不同桃品种(种质)对枝枯病的抗性。【方法】观察桃枝枯病田间症状。通过组织分离法对病样进行分离培养,观察分离物的形态特征,通过扩增测序其ITS、EF-1α和TUB基因序列进行分子鉴定,并对分离物进行致病性验证。选取优势病原菌种类,采用离体有伤接种枝条的方法测定37个桃品种(种质)对其的抗性,并根据病斑长度利用系统聚类方法对不同桃品种(种质)对枝枯病的抗性进行分级和评价。【结果】通过组织分离和纯化,获得54株分离物,经形态学观察和多基因系统发育分析结果显示,这些分离物有3个种,其中:35株为桃拟茎点霉(Diaporthe amygdali),5株为甜樱间座壳(Diaporthe eres),14株为葡萄座腔菌(Botryosphaer dothidea)。致病性测定试验表明,对接种后发病的病斑再分离鉴定,均能得到与原病原菌一致的菌株。抗性测定结果表明,根据病斑长度利用聚类分析将37个桃品种(种质)分为4类,类型Ⅰ有5个、类型Ⅱ有11个、类型Ⅲ有15个、类型IV有6个。抗性评价结果表明:供试品种(种质)中,免疫3个(光核桃、红花山桃和帚形山桃),占8.10%;抗病2个(白根甘肃桃和红根甘肃桃),占5.40%;中抗11个,占29.73%;感病15个,占40.54%;高感6个,占16.22%。【结论】无锡桃枝枯病的病原菌有3种分别为:D.amygdali、D.eres和B.dothidea,其中D.amygdali为优势种,分离频率为64.81%,不同桃品种(种质)对桃拟茎点霉菌的抗性不同,筛选到2个免疫品种(种质)、3个抗性品种(种质)。

杉木GRF和GIF基因家族鉴定、表达与互作分析

生长调节因子(GRF)和GRF相互作用因子(GIF)在植物的生长发育和逆境胁迫响应中发挥重要作用。为研究GRF和GIF基因在杉木生长发育和逆境胁迫响应中的功能,本研究基于杉木全长转录组数据,利用生物信息学手段共鉴定获得5个ClGRFs基因和2个ClGIFs基因。分析结果显示,ClGRFs氨基酸残基数目范围为386(ClGRF4)~723 aa(ClGRF3),等电点为7.07(ClGRF4)~9.26(ClGRF5);2个ClGIFs蛋白氨基酸数目分别为242和258 aa,等电点均在6左右,蛋白质分子质量分别为25.64和27.96 kDa。保守结构域和基序分析发现ClGRFs蛋白均含QLQ和WRC结构域,ClGIFs蛋白均含SSXT结构域,且高度保守。进一步分析结果显示,ClGRFs分别属于进化枝Ⅲ和进化枝Ⅵ,且均受miR396调控。表达分析结果表明,ClGRFs基因的表达具有一定的组织特异性,而ClGIFs在不同组织呈组成性表达,且ClGRFs和ClGIFs基因均能响应赤霉素(GA3)和水杨酸(SA)的处理。酵母双杂交结果表明5个ClGRFs蛋白和2个ClGIFs蛋白均存在互作关系。本研究结果为进一步研究杉木GRF和GIF基因的功能提供了理论基础。

换锦花LsMYB7基因克隆与功能研究

【目的】研究转录因子LsMYB7基因对换锦花Lycoris sprengeri花色苷积累的调控作用。【方法】采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法从换锦花花瓣中克隆获得花色苷形成相关R2R3-MYB转录因子LsMYB7基因,并进行生物信息学分析,再通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究LsMYB7基因对花色苷积累的调控作用。【结果】克隆到1条长951 bp的LsMYB7基因cDNA序列,开放阅读框(ORF)为825 bp,编码274个氨基酸,LsMYB7蛋白含有2个R2和R3结构域,属R2R3-MYB转录因子家族;系统进化分析表明LsMYB7与拟南芥Arabidopsis thaliana S22亚族基因聚为一类;LsMYB7亚细胞定位于细胞核,在不同花发育阶段和不同花色无性系中,LsMYB7基因表达与花色苷合成相关基因的表达趋势一致,主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达;LsMYB7基因沉默后,换锦花花瓣明显变短,颜色变深,且LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调。【结论】LsMYB7属R2R3-MYB转录因子家族S22亚族,通过正向调控LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷生物合成相关基因的表达促进花色苷积累。

氮缺乏对84K杨树组培苗光合特性及次生代谢的影响

研究氮缺乏对84K杨树组培苗生长的影响,以期为84K杨的育种与繁殖提供理论基础。以84K杨树组培苗为实验材料,通过氮缺乏处理,测定84K杨树组培苗的生物量、光合参数、叶绿素荧光参数,并进一步分析氮缺乏时全氮、全碳、碳氮比、总酚及抗氧化活性的变化。结果显示:随着培养基中氮含量的减少,84K杨树组培苗的干重、净光合速率(P n)和气孔导度(G s)均受到抑制,同时,氮缺乏导致84K杨树组培苗叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量及最大光化学效率(Fv/Fm)降低。此外,随着培养基中氮素的减少,84K杨树组培苗中全氮含量显著减少,碳氮比显著升高,总酚含量显著增加。抗氧化分析结果表明,培养基中氮含量越低,组培苗的抗氧化活性越好。相关性分析表明,生物量与光合参数及叶绿素含量之间存在极显著正相关,但与总酚含量之间存在负相关;全氮含量与总酚含量之间存在负相关,与全碳及碳氮比之间存在正相关;同时84K杨树组培苗总酚含量及抗氧化活性之间具有明显的相关性。研究结果表明:氮缺乏可对84K杨树组培苗的光合生理及次生代谢产物产生影响,不利于84K杨树组培苗的生长和光合作用,但促进了多酚等抗氧化物质的产生。本研究可为84K杨树的栽培管理提供理论依据和基础数据。

拟南芥GT47基因家族鉴定及不同胁迫下的表达特征

【目的】筛选拟南芥糖基转移酶GT47基因家族,进一步了解GT47基因家族的生物信息学特征,为其功能及抗逆性研究提供参考。【方法】利用生物信息学方法在拟南芥GT47基因家族中挖掘并鉴定出39个基因,并对这些基因进行系列分析。【结果】家族蛋白为亲水性蛋白质,大部分蛋白稳定性较差,亚细胞定位预测显示,大部分基因定位于高尔基体。蛋白质结构预测表明,α-螺旋和无规则卷曲是二级结构的主要组成部分,三级结构具有相似性。基因结构和保守基序分析发现,各亚族成员间具有相似的保守基序和进化的保守性。系统发育树分析显示,该基因家族可分为6个亚家族,基因在不同物种间具有一定保守性。启动子顺式作用元件分析表明,拟南芥GT47家族基因具有多种激素响应元件及非生物胁迫响应元件。表达模式分析表明,拟南芥GT47基因家族在不同组织中广泛表达,对6 h的热胁迫表现明显的响应,尤其是AT1G63450在冷、干旱、盐及2 h热胁迫下发生了下调,但是在6 h热胁迫下发生了上调。【结论】糖基转移酶基因在不同组织中的表达具有显著差异,能响应ABA激素信号传导并参与植物调控胁迫应激过程,对植物生长发育有重要意义。

灵空山辽东栎林种群生态位特征

利用样地调查数据,以物种重要值作为资源状态指标,应用Levins,Hurlbert生态位宽度公式和Levins生态位重叠公式对山西灵空山林区辽东栎Quercus liaotungensis群落6种乔木、8种灌木和11种草本进行了生态位宽度和生态位重叠计算。结果表明:灵空山林区乔木树种以辽东栎(Levins生态位宽度Bi=1.159 0,Hurlbert生态位宽度Ba=0.796 0),油松Pinus tabulaeformis(Bi=0.990 7,Ba=0.536 1)的生态位宽度值较大;灌木树种以三裂绣线菊Spireae trilo-bata(Bi=1.095 0,Ba=0.509 0)的生态位宽度值较大;而草本层中,披针薹草Carex lanceolata的生态位宽度值最大(Bi=1.309 7,Ba=0.948 5)。乔木、灌木、草本层各种群之间均有不同程度的重叠,重叠指数依乔木、灌木、草本层逐渐减少,总的表现为生态位宽度较大的物种对资源利用能力较强,与其他种群间的生态位重叠一般较大。

基于反射光谱的山核桃幼苗氮素营养状况分析

山核桃（Carya cathayensis）是世界著名的干果之一,也是重要的木本油料作物,其油味清香、营养丰富,是优良的休闲保健食品。山核桃长期以来产量不稳、大小年现象明显,通过肥水管理、病虫害防治等有效管理措施,

桑细菌性萎蔫病及其病原的红外光谱鉴别

为快速有效鉴别桑细菌性萎蔫病,比较了桑细菌性萎蔫病菌Enterobacter mori和引起相似田间发病症状的桑青枯病菌Ralstonia solanacearum的红外光谱。结果显示：在4 000.00~500.00 cm-1范围内,2种重要桑细菌病原存在5个共有峰,其中3个强度有显著性差异。此外,桑萎蔫病菌的红外光谱有1 399.10和1 079.45 cm-12个特征峰,桑青枯病菌的红外光谱有2 973.49,1 724.42,1 380.60,1 278.67,1 185.12,1 132.03,1 100.51和979.31 cm-1等8个特征峰。进一步分析和比较感染桑萎蔫病的桑枝和健康桑枝的红外光谱发现,感病枝和健康枝有5个相同的峰,其中4个强度有显著差异;此外,感病枝有1到643.92和1 407.31 cm-12个特征峰,健康枝中有1 635.83,1 506.36,1 423.59,1 374.97,1 328.57和1 108.82 cm-16个特征峰。为利用傅里叶红外光谱技术简便、直观和快速地鉴别桑细菌性萎蔫病及其病原提供了新的思路。

光皮桦BlSPL1转录因子基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

Squamosa promoter binding protein like genes(SPLs)对植物开花具有重要的调控作用。基于转录组序列并利用RACE技术从光皮桦中分离获得BlSPL1基因,其cDNA序列全长1 825 bp,包含开放阅读框长1 170 bp,编码389个氨基酸,与桃PpSPL1(EMJ10405)的同源性最高(67%),属于陆地植物SPLs基因家族的group VII分支。表达分析显示BlSPL1在光皮桦芽、雌花、雄花、幼苗中均有表达,在雄花和幼苗中表达量较低,但在芽发育成雌花过程中明显上调,推测其可能对早期的雌花形成起调控作用。同时,从57个不同的光皮桦无性系中克隆BlSPL1的基因组序列,进行单核苷酸多态性(SNP)分析,共检测到98个SNP位点,SNP频率为1/26 bp,多样性指数π为0.007 12。在外显子区域,共检测到28个SNP位点,其中11个为同义突变,17个为错义突变。进一步的连锁不平衡分析显示,随着序列长度的增加,不同光皮桦群体BlSPL1内的SNPs连锁不平衡在基因内部迅速衰退。

杉木木材结晶度的近红外预测模型建立及变异分析

木材结晶度的测定费用高、耗时长,所以基于近红外光谱技术快速测定结晶度很有实用价值。杉木Cunninghamia lanceolata是中国南方栽植面积最大的用材树种之一,结晶度作为衡量木材品质的重要指标,了解其变异对杉木无性系选育及木材加工技术改进都有实际意义。本研究样品来自广西、湖南和贵州等11个不同地理种源的杉木无性系,通过X衍射技术测定结晶度,结合近红外光谱技术通过偏最小二乘法建立相应的模型并对模型预测效果进行评价。通过模型预测未知样品,进而分析杉木木材结晶度在不同种源和无性系间的变异。当光谱区域为6 000~4 100 cm-1,光谱数据进行二阶导数和Savitzky-Golay平滑处理,运用偏最小二乘法建立的校正模型预测效果最好。校正模型相关系数r=0.987 5,校正均方差(RMSEC)为0.318;预测模型的相关系数r=0.921 3,预测均方差(RMSEP)=0.742。用未参与建模的已测定样品进行模型评价,其预测值与实测值之间的相关系数为0.905 0,平均标准偏差为0.301,该模型能预测杉木样品的结晶度。对164个杉木无性系木材结晶度测定结果的分析显示:平均值为44.52%,变幅为40.49%~49.75%,区间为42.06%~47.28%的占72.86%。按照地理种源分布,杉木木材平均结晶度湖南靖县种源的最小为43.45%,贵州黎平种源的最大为45.23%,方差分析表明种源间无显著差异(P=0.000 3),而无性系间具有显著差异。

野菊根系分泌物的鉴定及其对三种植物的化感效应

利用GC-MS,比对植物体茎叶、根系分泌物、植物根际土壤3个醇提取物中共有成分,以确定出野菊(Chrysanthemum indicum)根系分泌物所产生的主效化感物质。在此基础上,应用外源法测定2,4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二乙酯在4个不同浓度下对油菜(Brassica napus L.)、生菜(Lactuca sativa var.ramosa Hort.)、莴苣(L.sativa L.)3种化感敏感植物种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明,野菊根系分泌的主要化感物质有2,4-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二乙酯,且2,4-二叔丁基苯酚对3种植物的抑制作用随着浓度的增加而增强;邻苯二甲酸二乙酯在0.05 mmol/L浓度下对油菜有明显的促进作用,在0.05 mmol/L和0.10 mmol/L浓度时,对生菜鲜重、莴苣和油菜胚根生长具有促进作用。

野菊多糖对白术土传病害的防效试验

本文研究了野菊多糖对白术土传病害的防治效果,试验分为温室盆栽试验和大田试验两部分。温室盆栽试验表明,0.2、2和20 mg/m L的野菊多糖药剂在药后10 d对白术土传病害的防控效果分别为6.277%、83.863%和71.839%;田间试验表明,0.4、2和20 mg/m L的野菊多糖药剂在用药后60 d对白术土传病害的防效分别达到57.836%、74.925%和82.470%,其中2和20 mg/m L的野菊多糖药剂对白术病害的防效显著高于常用药剂百菌清。同时野菊多糖对田间白术有较好的促生作用,0.4、2和20 mg/m L的野菊多糖药剂分别比百菌清药剂组单位面积产量增产了17.647%、14.706%和32.353%。

^(137)Cs-γ辐照及5-氮杂胞苷处理毛竹种子对其实生苗甲基化水平的影响

为了研究药物和辐照对毛竹甲基化水平的影响,采用0、25、50、100、250μmol·L-1的5-氮杂胞苷和0、10、20、30、40、60、90、120 Gy的^(137)Cs-γ射线分别处理毛竹种子,并利用高效液相色谱技术,采用外标法测定实生苗叶片的甲基化水平。结果表明,5-氮杂胞苷处理毛竹种子后,甲基化水平下降,其中250μmol·L-1处理后甲基化水平为20.8%,下降最显著;低剂量的辐照处理对甲基化的影响不明显,而在高剂量的γ射线胁迫下,DNA甲基化程度下降至26.0%,达到极显著水平。本研究揭示了辐照与基因组甲基化水平间的相关性,为毛竹辐照诱变和甲基化抑制育种提供了科学依据。

植物不定根诱导生成机制研究进展

不定根诱导发生是研究植物发育和形态建成的一个重要理论课题,也是优良林木无性繁殖、成功实现转基因材料植株再生以及加速林业产品原料植物规模化栽培的关键问题。植物不定根的发生是一个十分复杂且多因素影响的过程,是植物体内的内源因素和体外的外源因子共同作用的过程。该研究通过归纳国内外关于不定根发生的形态解剖、生理生化、植物分子方面的研究进展,分析不定根发生过程中存在的不同影响因素及其影响效果,以期为植物不定根诱导研究提供有力的理论依据,并为实践中植物无性繁殖诱导不定根提供参考依据。

发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化

闽楠[Phoebe bournei(Hemsl.)Yang]为我国重要的珍贵树种。为建立闽楠遗传转化体系,以闽楠幼苗为材料,利用pCAMBIA1300-GFP质粒转化的发根农杆菌介导植株转化。在比较注射和菌液浸泡两种侵染方式侵染效率的基础上,进一步利用正交[L9(3^(3))]试验从菌株种类、菌液侵染浓度和侵染植株苗龄三个方面优化了遗传转化体系。另外,对不同光强影响闽楠毛状根诱导及转化率情况进行了分析。结果表明,注射法的毛状根诱导率和遗传转化率分别为80.0%、66.7%;而菌液浸泡法的诱导率和遗传转化率分别为41.2%、35.3%。正交试验中,影响闽楠毛状根诱导率和遗传转化率的主要因素为菌株种类。最大诱导率和转化效率分别达到了87.5%、70.6%。该体系的最优组合为:K599菌株在菌液浓度OD_(600)=1.2条件下注射侵染三叶期的闽楠幼苗。此外,较弱光强(50μmol·m^(-2)·s^(-1))的培养条件比较强光照(100μmol·m^(-2)·s^(-1))更有利于闽楠幼苗的生长和遗传转化。本研究创建并优化了一套高效、稳定的闽楠遗传转化体系,成功获得了具有转基因毛状根的闽楠植株,为闽楠重要基因挖掘、新种质创建和遗传改良奠定了基础。

低氮胁迫对杉木幼苗生长及生理的影响

氮是植物生长发育过程中必不可少的营养元素。以FK,S39,S3和新6四个杉木Cunninghamia lanceolata无性系的萌芽条扦插苗为材料,采用营养液气雾栽培法,分析低氮(low nitrogen,LN)胁迫对杉木不同无性系幼苗生长和生理的影响。结果表明,LN抑制杉木幼苗生长,促进根系的生长,降低叶片长宽比,增加根冠比;LN胁迫使叶片中丙二醛的含量增加,叶绿素a和叶绿素b的含量降低,可溶性蛋白的含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物歧化酶(POD)活性增加。

离子色谱HPAEC-PAD法测定杨树细胞壁非纤维素单糖组分

为建立杨树(Populus spp.)细胞壁中非纤维素单糖的离子交换色谱-脉冲安培检测方法(HPAEC-PAD),通过对分离条件的优化,细胞壁中主要9种单糖可以通过一次进样,达到基线分离的效果。试验采用Dionex CarboPac^(TM)PA100(4 mm×250 mm)分析柱,以氢氧化钠为淋洗液进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为30℃的色谱条件,测定不同杨树种类细胞壁中单糖组分。结果表明,9种主要细胞壁单糖在0.5~150.0 mg·L^(-1)线性范围内线性关系良好,相关系数R^(2)为0.9990~0.9993,方法的重现性(RSD)为1.09%~3.96%,加标回收率为91.32%~109.25%,最低检出限为1.57×10^(-3)~1.41×10^(-2)mg·L^(-1)。试验结果表明杨树组培苗茎段细胞壁中半乳糖醛酸占比最高,其次为木糖,葡萄糖醛酸占比最低。本研究建立的方法适用范围广,操作简单,可用于杨树及其他物种细胞壁中单糖的检测。