拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用

【目的】磷脂酸(PA)是甘油脂生物合成的前体,又是参与植物生长发育调节和各种逆境响应的重要信使物质,然而目前对植物细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。本研究试图构建一种能有效监测植物细胞PA含量变化的荧光探针,并用之测定盐碱胁迫过程中胞内PA含量的变化。【方法】将Spo20p蛋白中高度专一的PA结合域相对应的核苷酸序列与绿色荧光蛋白基因融合,经遗传转化获得携带该融合基因的转基因拟南芥Arabidopsisthaliana株系,其表达受组成型启动子UBQ10驱动,产生的融合蛋白成为专一结合PA的荧光探针。随后,运用该荧光探针监测盐碱胁迫下胞内PA含量的变化。【结果】构建获得7个不同的纯合、单插入位点转基因拟南芥株系。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析显示:不同株系中融合基因的表达量存在差异。不同浓度外源PA处理试验显示:随着表达量的升高,PA探针可有效监测到2μmol·L^(-1) PA处理根尖10 min后细胞中PA含量的变化;而当PA探针表达量较低时,对PA监测灵敏度显著下降,表明在一定程度上荧光探针对PA监测的灵敏度与其表达量相关联。运用PA荧光探针发现:盐碱胁迫处理根尖5 min即可诱导质膜上或胞内PA的积累,暗示PA在植物早期盐碱胁迫响应中可能产生重要作用。【结论】本研究构建了一种可对细胞内PA含量进行有效监测的荧光探针,该探针可用于监测植物盐碱胁迫早期响应过程中胞内PA水平的变化,从而为早期逆境响应研究提供新工具。

拟南芥和油菜3-磷酸甘油酰基转移酶的关键活性位点鉴定

【目的】3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)催化三酰甘油(TAG)生物合成途径中的第1步酰化反应,TAG合成能力是油料作物的关键性状,但亦与人类肥胖症密切相关,了解GPAT结构与功能的内在关系对于这一性状的遗传或化学遗传调控至关重要。本研究旨在鉴定调控植物GPAT活性的关键氨基酸位点。【方法】运用定点突变技术构建了58个GPAT9突变基因,结合GPAT特异的酵母遗传互补法,剖析单一和多个氨基酸位点改变对GPAT9酶活性的影响。【结果】通过对拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9和油菜Brassica napus BnGPAT9的19个氨基酸残基进行分析发现:AtGPAT9的N端6个磷酸化位点的单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性。相反,其他6个位于酰基转移酶保守结构域外的氨基酸残基(85、114、119、230、237、322位)的改变能够显著影响GPAT9酶活性。发现这些氨基酸残基之间存在交互作用,例如,3个位点同时突变(Y85W/N119H/S237N)能使AtGPAT9活性大幅上升,加速酵母的生长并促进TAG的合成,表达这一突变酶的酵母中的TAG含量比表达野生型BnGPAT9的增加了45.7%。更值得注意的是,在114和237位磷酸化氨基酸残基对酰基转移酶活性产生负面效应,暗示植物GPAT9活性可能受磷酸化和非磷酸化机制调节。【结论】本研究获得了6个未经报道的关键GPAT酶活性调控位点,其中W85和H119是GPAT9正常功能所必需的,而L114、D230、N237和A322有利于维持GPAT9活性。

功能丧失突变透示ATS1对拟南芥种子发育的非必需作用

【目的】甘油脂是生物膜的重要组成成分,植物中的ATS1催化甘油脂原核合成途径的第1步酰化反应,但目前ATS1在植物正常生长发育中的功能并不完全清楚。本研究运用反向遗传学手段剖析ATS1功能丧失对植物生长发育的影响。【方法】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建拟南芥Arabidopsis thaliana ATS1基因功能丧失型突变体,并比较分析突变体与野生型在整个生育期的表型差异。【结果】分子鉴定显示:多个突变体中ATS1基因的第1个外显子碱基数呈非3的倍数的缺失或插入,从而导致移码突变或翻译提前终止。这些突变体的叶片中多不饱和脂肪酸C16:3的含量急剧下降,而C18:3含量则显著增加。相随的表型分析显示:ATS1基因功能丧失有时会使叶片略显黄色,但对种子发育未产生可见影响。【结论】在正常生长条件下,ATS1并非拟南芥种子发育所必需的。