慢病毒载体大规模生产技术的探究

为改进慢病毒载体生产过程中规模小、生产量不足以及滴度偏低等问题,采用悬浮培养293FT细胞方式,从培养基选择、细胞接种密度、质粒用量等方面对慢病毒包装条件进行优化,通过电击转染并结合生物反应器扩大生产,用离子交换色谱进行纯化以实现慢病毒大规模生产。结果显示以国产培养基M1进行前期细胞扩增培养,用3.75μg/mL质粒电击转染293FT细胞,转染后以2.0×10^(6)/m L的密度接种在优化的2 L生物反应器,用M2培养基培养,最终获得的慢病毒载体滴度达到1.8×10^(12)TU/mL。表明本团队研究的慢病毒载体大规模生产技术可以实现单批次、高滴度、无菌性慢病毒载体的生产,从而为满足临床试验与临床治疗提供基础和保障。

靶向PD-1的shRNA慢病毒载体的构建

目的:设计以PD-1基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒载体,鉴定此RNA干扰系列对PD-1基因表达的影响,从设计序列中筛选高(>90%)干扰效率的靶点序列(PD694/791)。方法:设计合成3种PD-1的shRNA干扰序列,与LV3载体连接,进行阳性鉴定,通过免疫印迹法(western)和阳性细胞数量检测筛选高干扰效率靶序列。结果:基于转染目的细胞的PD-1蛋白western检测结果,计算三种shRNA慢病毒载体的干扰效率分别为:PD791干扰效率为78%、PD 238干扰效率为8%、PD 694干扰效率88%。结论:成功构建靶向PD-1的shRNA慢病毒载体,其中干涉片段PD694和PD791对PD-1的干涉抑制效果显著,可以有效抑制原代T细胞PD-1表达,为研究开发PD-1抑制剂治疗肿瘤奠定基础。

靶向肿瘤细胞PD-L1的shRNA慢病毒干扰载体的构建

目的:利用RNAi技术构建靶向抑制肿瘤细胞PD-L1表达的shRNA慢病毒干扰载体,用于解除肿瘤细胞的免疫逃逸机制。方法:利用Designer3.0(Genepharma)软件以PD-L1为靶点设计4种shRNA基因序列,将shRNA序列插入到慢病毒载体中,连接产物转化后在选择性培养基上筛选阳性菌落并提取重组质粒,进行双酶切及测序鉴定,荧光显微镜观察慢病毒转染效果,westernblot对目的基因PD-L1四个靶点筛选获得PD-L1蛋白表达并计算出重组慢病毒的干扰效率。结果:限制性核酸内切酶Xba I和Nhe I双切鉴定结果皆为1000 bp大小的阳性重组载体;测序结果与shRNA模版一致;荧光显微镜观察结果显示慢病毒转染效果较好;western blot结果显示SH1、SH4组PD-L1表达无抑制,SH2、SH3组PD-L1表达有抑制;SH1组干扰效率19.75%,SH2组干扰效率32.10%,SH3组干扰效率40.74%,SH4组干扰效率7.41%。讨论:SH3组重组慢病毒对PD-L1表达有抑制作用且干扰效率最高,成功构建了一款靶向肿瘤细胞PD-L1的shRNA慢病毒干扰载体,为利用RNAi技术干扰PD-L1靶点的肿瘤免疫治疗奠定了实验基础。