扁桃酸在大鼠、小鼠和兔组织中的立体选择性代谢(英文)

目的研究扁桃酸(MA)在大鼠、小鼠和兔组织中的立体选择性代谢,探讨MA代谢酶存在的部位、辅酶依赖性等性质以及可能的种属差异。方法MA对映体与大鼠、小鼠和兔的肝脏、肺、肾脏S9和微粒体共孵育,HPLC检测代谢并用柱前衍生化方法进行手性分析。同时考察辅酶NADH和NADPH及醇脱氢酶竞争性底物乙醇和抑制剂4-甲基吡唑对S-MA代谢的影响。结果S-MA在大鼠肝和肾S9中被代谢为PGA,而R-MA无代谢。两对映体在小鼠和兔组织中均不被代谢。乙醇和4-甲基吡唑不影响酶的活性,该代谢顺利进行的重要辅酶是NADPH而非NADH。结论大鼠中参与MA立体选择性代谢的酶是存在于胞浆或线粒体中的具有NADPH依赖性的非微粒体酶,而不是醇脱氢酶。MA的立体选择性代谢存在种属差异性。

重组人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的克隆表达及应用

克隆、表达人和大鼠醇脱氢酶(ADH)、醛-酮还原酶(AKR)基因全长cDNA,研究扁桃酸(MA)代谢机制。设计引物,利用RT-PCR克隆人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶基因全长cDNA。测序正确的cDNA被克隆到表达载体pET-28a(+)上并在大肠杆菌BL21(DE3)中稳定表达。利用亲和色谱纯化相应的酶,通过检测其在340 nm吸收度值的变化进行酶活性测定。获得的醇脱氢酶与扁桃酸,醛-酮还原酶与苯乙酮酸(PGA)共孵育,采用HPLC分析其代谢和转化情况。通过测序,目的蛋白的cDNA序列完全正确,在宿主菌中获得良好的可溶性表达,经Ni2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯,具有较好的催化活性。人ADH2对扁桃酸的代谢具有立体选择性,优先代谢S-MA,对S-MA的代谢能力较强。大鼠ADH1对扁桃酸无代谢活性,人和大鼠AKR对苯乙酮酸均无代谢。成功构建人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的表达质粒,获得高活性的蛋白。这些重组酶模型可以用于由醇脱氢酶和醛-酮还原酶介导的药物代谢研究。