动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7 wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC).人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g.样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100～5.8×100CFU/mL(或CFU/g).试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染.

绿源素与甜菜碱预防肉鸡球虫病的效果试验

为探讨绿源素与甜菜碱预防肉鸡球虫病的效果,试验选用4种常用的抗球虫药物及绿源素与甜菜碱组合进行对比试验。以抗球虫指数(ACI)、病变值、卵囊数及粪便记分为试验指标,进行综合评价。试验结果表明,绿源素单独使用平均抗球虫指数为149.06,盲肠病变值降低56.48%,盲肠卵囊数减少72.52%,平均粪便记分降低44.52%;绿源素与甜菜碱配合使用平均抗球虫指数为171.95,盲肠病变值降低76.85%,盲肠卵囊数减少75.26%,平均粪便记分降低74.93%。绿源素单独使用的抗球虫效果低于绿源素与甜菜碱配合使用的抗球虫效果,绿源素与甜菜碱配合使用的抗球虫效果达中等以上有效水平。

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P<0.05).

鸡白细胞介素2真核表达质粒的构建、表达及对AIV疫苗免疫增强作用研究

将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因亚克隆入pCI载体中,pEGFP-N1载体中的EGFP基因酶切后连入质粒pCI-ChIL-2中,构建真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP,该载体表达ChIL-2-EGFP融合蛋白。重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和外周血淋巴细胞(PBLC),荧光显微镜观察到融合蛋白在体外能稳定表达。HI试验显示,pCI-ChIL-2-EGFP与AIV疫苗共注射可明显提高AIV疫苗的免疫原性。

重组鸡白介素18真核表达质粒(pCI-ChIL-18)胚胎接种的研究

通过对孵化率、平均囊指数、脾指数、外周血淋巴细胞增殖反应和白介素18(IL-18)蛋白水平表达的检测,评定了重组鸡真核表达质粒(pCI-ChIL-18)胚胎接种的不同接种剂量和接种方法的效果。结果表明,pCI-ChIL-18质粒接种18日龄鸡胚不影响孵化率,对鸡的生长发育无影响,不同的接种途径和接种剂量对鸡体内IL-18的表达有影响。与1日龄雏鸡肌肉接种比较,胚胎接种可明显促进外周血淋巴细胞的早期增殖,而且呈剂量依赖性,但相同接种途径的200μg接种组与300μg接种组间无统计学差异(P>0.05)。

重组鸡白细胞介素2质粒在体内的分布研究

3周龄雏鸡肌肉接种200μg重组鸡白细胞介素2真核表达质粒(pCI-chIL-2).PCR法检测血清、心、肝、肺、脾、法氏囊和肌肉接种部位中pCI-chIL-2的残留情况,利用竞争PCR观察血清中重组质粒的动态分布,RT-PCR检测上述组织器官pCI-chIL-2的表达情况.结果表明:接种后2 h血清中即可检测到pCI-chIL-2,8 h达到高峰,7 d时已检测不到;pCI-chIL-2在上述组织器官中存在的时间比较长,1～14 d各组织器官中均有分布,19 d时肺和法氏囊中已检测不到;RT-PCR结果显示pCI-chIL-2转录的mRNA在各组织于不同时间均有存在.本研究为重组chIL-2作为免疫增强剂的应用提供体内试验数据.

瑞士乳酸杆菌HZ521株的分子鉴定及其部分生物学特性研究

根据GenBank中乳酸杆菌16 S^23 S rRNA基因间沉默区序列设计引物,进一步鉴定猪源乳酸杆菌分离株HZ521;并通过体外试验,以嗜酸乳酸杆菌ATCC 4356为参考菌株,探讨HZ521株的益生素作用。部分16 S^23 S rRNA基因序列同源性分析结果表明,该分离株属于瑞士乳酸杆菌。HZ521株具有较强的产酸能力,能耐受强酸,对Hela细胞的黏附率为87.2%,显著高于ATCC4356株(P<0.01)。表明瑞士乳酸杆菌HZ521株具有益生素特性,可作为肠道益生素的候选菌株。

鸡胚接种鸡白介素18重组质粒对IBDVDNA疫苗免疫增强作用的研究

用鸡白细胞介素18(ChIL-18)重组质粒(pCI-ChIL-18)接种18胚龄SPF鸡胚,利用适时荧光定量PCR方法对试验鸡不同时间点的动态变化进行检测。检测结果表明,胚胎接种pCI-ChIL-18使ChIL-18在鸡血液中早期持续高浓度存在,能促进鸡脾脏和法氏囊中ChIL-18基因的大量表达。用pCI-ChIL-18与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫18胚龄SPF鸡胚,设1日龄雏鸡肌肉免疫对照组和空白对照组,2周龄时二免,6周龄时用IBDV标准强毒株BC6/85攻击。结果表明,胚胎免疫pCI-ChIL-18能显著促进试验鸡T、B淋巴细胞的早期增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的早期抗体水平及其对强毒攻击的保护力。并进一步证明胚胎免疫pCI-ChIL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的早期免疫效果具有显著的增强作用(P<0.05)。

减毒沙门氏菌作为原核表达宿主菌和真核表达载体的研究(英文)

本研究以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,探讨了减毒沙门氏菌作为原核表达宿主菌和真核表达载体的可行性.通过多功能分光光度仪测定细菌的OD600和eGFP在大肠杆菌和减毒沙门氏菌中的表达量,结果表明:eGFP在沙门氏菌中的表达量依赖于IPTG的浓度,最佳浓度为0.5 mmol?L-1,增加浓度至0.75 mmol?L-1不能增加eGFP的表达量;而该现象在大肠杆菌中不明显.当IPTG浓度等于或大于0.5 mmol?L-1时,沙门氏菌中eGFP的表达量显著高于大肠杆菌.若以相对荧光度(1个OD600单位的荧光值,即eGFP相对表达量)表示,两种宿主菌的最佳诱导时间均为3 h.Hela细胞侵袭力试验表明该减毒沙门氏菌仍具有侵袭力,同时以脂质体转染为对照,将携带重组质粒pcDNA3-eGFP的减毒沙门氏菌转染Hela细胞,48 h后可观察到绿色荧光,表明了该菌可作为载体将重组质粒携带到细胞内,并使外源基因得到表达.此外,利用基于微孔板的多功能分光光度仪可直接检测荧光强度和OD值,能快速、准确地进行多样本检测,可用于GFP在不同宿主菌或相同宿主菌在不同试验条件下,甚至不同表达载体在相同宿主菌中表达等方面的研究.

单核细胞增生李斯特菌σ~B启动子报告质粒的构建及其在应激研究中的应用

为探索人畜共患单核细胞增生李斯特菌的应激调控因子Sigma B（σ^B）在抗应激过程中的激活机制,本研究以pERL3为骨架,通过SOE-PCR技术构建携带3种不同σ^B依赖型启动子控制下的gfp基因的报告质粒,并利用荧光酶标仪分析携带这些报告质粒载体的单增李斯特菌在酸或盐应激条件下的σ^B活性以及不同σ^B调控子在应激条件下对σ^B激活能力的影响。结果显示：sigB自身启动子PsigB比P0880和P1602更为敏感,可以准确指示σ^B的活性;盐应激比酸应激对σ^B的激活程度高;5%的NaCl和30 min的应激时间足以对σ^B产生显著的激活效应;rsbS、rsbT和rsbV基因缺失显著降低σ^B在应激中的激活水平,而rsbX基因不介导应激诱导的σ^B激活。本研究所构建的GFP报告质粒可以准确指示单增李斯特菌的σ^B活性,可以用于应激条件下σ^B激活机制的研究。

李斯特菌毒力因子及其进化

李斯特菌属包含6个种,毒力各有差异。在细菌耐受外界环境、黏附侵袭及细胞内感染过程中,毒力因子各司其职又相互协作。毒力基因常聚集为毒力岛,其中PrfA依赖型毒力基因簇(LIPI-1)与内化素岛(LIPI-2)是致病种最重要的两个毒力岛。李斯特菌各个种可能来源于同一个携带有完整毒力岛的祖先,在长期进化过程中,通过基因水平转移或重组、整合等事件,演化为目前流行的6个种。噬菌体、转座子、质粒等可能扮演着毒力进化执行者的角色。一些天然非典型菌株是目前研究的热点,如含有LIPI-1的无害李斯特菌和缺失LIPI-1的塞氏李斯特菌,其演化进程可能尚未达到或已超越目前流行的状态,为李斯特菌毒力进化的研究提供了重要线索。

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板,设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增,获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段,BamHⅠ/HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c,获得重组质粒分别命名为pET32c-HNa、pET32c-HNb和pET32c-HNa-L-b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。

新城疫病毒F蛋白结构域基因原核表达与抗原表位分析

以含新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因的重组质粒为模板,设计特异引物进行重叠-延伸PCR扩增获得F基因的抗原结构域基因片段Fa、Fb和Fa-l-Fb,经SalⅠ和NotⅠ酶切后,定向插入原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-Fa、pGEX-Fb和pGEX-Fa-l-Fb;用定点突变方法获得重组质粒pGEX-Fa-mut.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,转化菌经IPTG诱导、提取表达产物进行蛋白电泳和免疫印迹分析.结果表明:Fa-mut、Fb和Fa-l-Fb结构域基因均获得了融合表达,表达产物与NDV阳性血清具有免疫反应性;与pGEX-Fa-mut不同,pGEX-Fa重组质粒在大肠杆菌中未能表达,且转化菌在IPTG诱导过程中未见生长,提示未经突变的Fa片段可能为毒性蛋白.三维结构预测结果显示,目的蛋白片段中均保留F蛋白中原有相应的抗原表位.

单核细胞增生李斯特菌弱毒株主要毒力基因表达水平分析

单核细胞增生李斯特菌是重要的食源性病原菌,可引起人与动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产等。其感染过程的每一步均由特定的毒力因子介导。本试验应用荧光定量PCR,比较分析单核细胞增生李斯特菌弱毒株H4(4a型)与强毒株10403S(1/2a型)、681(4b型)主要毒力基因(prfA、plcA、hly、mpl、ac-tA、plcB、inl A、inlB和sigB)的表达水平差异。除应激调控因子σB(sigB)外,H4株主要毒力基因的表达水平均显著高于10403S与681。膜裂解因子的高表达导致H4更易暴露于宿主免疫系统而被清除,从而引起毒力下降。本研究为探明这类菌株的弱毒机制奠定了基础。

携带新城疫病毒融合蛋白基因的重组减毒单核细胞增多性李斯特菌构建与鉴定

以鸡新城疫病毒F基因(NDV-F)为模式外源基因,通过基因切割-重叠延伸PCR法(SOE-PCR)将其插入到单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)毒力基因hly的启动子和信号肽序列下游,并将该融合片段克隆入穿梭质粒pKSV7,随后将重组质粒电转李斯特菌进行同源重组。NDV-F基因的PCR扩增表明该重组菌构建成功,RT-PCR结果表明F基因在重组菌中得到了转录。比较了重组菌和野生型菌株的溶血性、黏附和侵袭力、对小鼠和鸡胚的毒力和生长特性以及重组菌的体内外稳定性,结果表明:hly基因中F片段的整合消除了单核细胞增多性李斯特菌溶血素基因的表达,其培养上清液没有溶血性,而野生型菌株的溶血价达24;细胞试验表明重组菌对细胞的黏附力和相对侵袭力均有不同程度的降低,而相对侵袭力与野生型菌株具有显著性差异(P<0.05);重组菌对小鼠及鸡胚的毒力(LD50)与野生型相比分别下降3.7和6.5个对数数量级;重组菌在BHI肉汤和小鼠体内连续5次后,仍然可以扩增出目的基因NDV-F,初步表明该重组菌较为稳定。

猪链球菌2型分离株对野生斑马鱼的致病性

以野生斑马鱼为模式动物,对6株mrp+epf+sly+猪链球菌2型(SS2)分离株进行致病性比较。斑马鱼经腹腔接种不同稀释度的SS2分离株,连续观察5d,Kaplan-Meier生存曲线分析并统计半数致死量(LD50)。结果显示,6个分离株对斑马鱼的LD50在105cfu^106cfu之间,临床株与非临床株的毒力差异不显著(P>0.05)。从攻毒后死亡的鱼腹腔和脑可分离到SS2,并伴有腹腔出血及肝、肠、脑部炎性病变。表明SS2可感染斑马鱼,为进一步研究SS2的体内感染机制及毒力因子功能等奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中非结构蛋白Nsp2表达分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组蛋白纯化后作为免疫抗原,制备Nsp2特异性单克隆抗体。将携带nsp2基因的真核表达载体转染至Marc-145及HEK293细胞,或将PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间点收集细胞样品。免疫荧光观察Nsp2在转染细胞中的亚细胞定位,免疫印迹分析Nsp2在真核细胞中的表达。筛选获得了1株稳定分泌特异性抗Nsp2的单克隆杂交瘤细胞株,能用于免疫荧光和印迹分析。重组真核表达质粒转染Marc-145与HEK293细胞后,Nsp2主要定位于细胞质中,免疫印迹检测到约为120与50ku的蛋白条带。PRRSV感染Marc-145细胞4h即可检测到Nsp2的表达,主要定位于细胞核周围,随着感染时间延长Nsp2分布范围逐渐扩大至整个细胞质。病毒感染8h,可检测到120ku左右的Nsp2蛋白条带,感染后12h可检测到70和50ku左右的Nsp2蛋白,且蛋白表达量随感染时间延长显著增多。PRRSV感染细胞中Nsp2的表达与剪切分析,为深入研究该蛋白在病毒复制和致病中的功能奠定了基础。

两种荧光定量PCR方法检测猪瘟病毒的比较及应用

根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)5端非编码区保守区域,设计猪瘟病毒特异性的引物和探针,建立了基于SYBR Green和TaqMan探针的两种荧光定量PCR检测方法。灵敏性和特异性试验结果表明,两种方法能够特异性地检测出不同型的猪瘟病毒,而对同属的牛病毒性腹泻病病毒以及其它一些主要猪病病原检测结果均为阴性。两种方法对猪瘟病毒C株的检测下限均为101TCID50,均高于常规的套式PCR。用携带该基因片段的重组质粒为模板进行检测,SYBR Green方法的检测下限为3×100copies,比TaqMan探针方法更加灵敏(3×101copies)。应用建立的SYBR Green方法对2009年采集于浙江地区不同猪场的20份病猪样品进行CSFV检测,有8份样品为阳性,与套式PCR方法检测结果一致。进一步应用SYBR Green方法对不同感染阶段细胞内病毒RNA复制水平进行检测,与病毒滴度的结果基本一致。因此,本研究建立的SYBRGreen荧光定量PCR检测方法能够应用于组织和培养细胞中猪瘟病毒的检测。

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达与抗原性分析

研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性。将VP1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性。目的蛋白经纯化后用ELISA分析其与猪疫苗血清的免疫反应性,结果显示该重组VP1蛋白(rVP1)只能与部分O型FMDV疫苗血清反应。推测当前使用的不同O型FMDV疫苗毒株在VP1重要中和抗原位点G-H环(134 aa^158 aa)与C末端(200 aa^213 aa)存在较大差异。