血管生成素研究的希望与挑战——浙江大学血管生成素研究

虽然血管生成素发现于1985年,但由于其性质上的特殊及研究条件的限制,人类对其功能的了解进展缓慢.浙江大学血管生成素研究组建立于2001年,主要从蛋白质相互作用、基因转录调控、RNA代谢等层面研究血管生成素的功能机制,发现该蛋白能够与卵泡抑素、磷脂混杂酶1等蛋白质相互作用而细调r RNA的转录水平;在RNA转录中发挥表观遗传修饰调控因子作用;通过与细胞骨架相关蛋白的相互作用而促进细胞迁移;mi R-409-3p通过直接靶向下调该蛋白的表达而发挥抑癌基因的作用.同时,在模式生物斑马鱼中揭示了血管生成素同源基因对胚胎早期发育的影响.本文全面回顾了我们14年来在血管生成素方面的研究进展,探讨了当前研究中存在的问题,并展望了未来的发展方向.

核糖核酸酶A专栏导读

长久以来,我们“顾名思义”,“理所当然”地认为核糖核酸酶A的功能就是降解核糖核酸(RNA)。事实上,随着研究的深入,发现该家族不少成员不仅能降解RNA,而且能精准地在特定位点切割RNA产生功能性非编码RNA,甚至具有“非酶”功能!例如,我们课题组研究的核糖核酸酶A超家族成员5(ribonuclease 5,也称angiogenin,中文译为“血管生成素”)不仅以酶的形式参与RNA代谢(主要是rRNA、tRNA和miRNA)。

核糖核酸酶A超家族:不仅仅是一组降解RNA的酶

核糖核酸酶A超家族(ribonuclease A superfamily;RNase A superfamily),也称脊椎动物分泌型核糖核酸酶超家族(vertebrate secreted ribonucleases superfamily),是二十世纪蛋白质结构、酶学和分子进化领域研究最多最广泛的核糖核酸酶家族。自上世纪初期从牛胰腺中分离鉴定第一个成员以来,已从哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鸟和鱼等几百种动物中鉴定了几千个成员。早期对该家族成员的研究不仅促进了蛋白质化学技术的发展,而且为现代生物学研究奠定了基础。目前已知人的核糖核酸酶A超家族成员包括8个典型成员(RNase 1~RNase 8)和5个非典型成员(RNase 9~RNase 13)。功能方面,曾一度以为该家族成员只具有降解核糖核酸的能力。随着血管生成素(angiogenin;RNase 5)、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素(eosinophils-derived neurotoxin, EDN;RNase 2)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophils cationic protein, ECP;RNase 3)的发现,人们意识到该家族成员除了消化核糖核酸外,还有依赖酶活性和不依赖酶活性的其他功能,包括宿主防御、免疫调节、血管生成和肿瘤抑制等,但仍了解不够全面。本文回顾了核糖核酸酶A超家族的研究历程,探讨了未来研究方向,特别呼吁要系统研究其除降解核糖核酸外的其他生理病理功能,希望能为该领域的研究提供思路。

核糖核酸酶A超家族抗菌活性评价

抗菌肽是机体重要的免疫防御分子,具有广谱杀菌活性。核糖核酸酶A是脊椎动物特异性的分泌型蛋白质,在人基因组中包含8个经典成员(RNase1-8)。它们作为一类重要的抗菌肽,广泛分布于机体需要抵抗外界病原微生物的组织中,除了特有的生物学功能外,均具有一定的抗菌活性。然而,目前各实验室对它们抗菌活性的报道并不一致,有必要开展横向比较分析。为此,我们表达纯化了人核糖核酸酶A超家族8个成员的重组蛋白质,并在同一实验条件下以半致死浓度评估了它们对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抗菌活性。结果显示,RNase1-8重组蛋白质对大肠杆菌半数致死浓度分别为:0.081,0.046,0.008,0.250,2.028,0.072,0.001μmol·L~(-1)和1.1416μmol·L~(-1);对金黄色葡萄球菌半数致死浓度分别为:3.427,1.856,2.211,5.188,8.274,4.356,2.502μmol·L~(-1)和9.916μmol·L~(-1)。该结果提示,RNase1-8对大肠杆菌的抗菌活性存在明显差异,其中RNase3和RNase7活性最强,且均显著高于各自对金黄色葡萄球菌的抗菌活性;8个成员对金黄色葡萄球菌的抗菌活性无明显差异。据此我们认为,核糖核酸酶A超家族对革兰氏阴性菌具有较好的杀伤活性,可用于革兰氏阴性菌抗菌产品的开发。

蛋白质相互作用数据库及其应用

对蛋白质相互作用及其网络的了解不仅有助于深入理解生命活动的本质和疾病发生的机制,而且可以为药物研发提供靶点.目前,通过高通量筛选、计算方法预测和文献挖掘等方法,获得了大批量的蛋白质相互作用数据,并由此构建了很多内容丰富并日益更新的蛋白质相互作用数据库.本文首先简要阐述了大规模蛋白质相互作用数据产生的3种方法,然后重点介绍了几个人类相关的蛋白质相互作用公共数据库,包括HPRD、BIND、IntAct、MINT、DIP和MIPS,并概述了蛋白质相互作用数据库的整合情况以及这些数据库在蛋白质相互作用网络构建上的应用.

AO/EB染色法及流式细胞术检测DMF诱导人肝细胞凋亡

目的观察二甲基甲酰胺(DMF)诱导正常成人离体肝细胞凋亡情况。方法以50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L和200mmol/L剂量DMF对正常成人离体肝细胞染毒。采用AO/EB双重染色法进行形态学观察;流式细胞术检测细胞凋亡率变化。结果AO/EB染色可见:活细胞核染色质着绿色,死亡细胞核染色质着橘红色,晚期凋亡细胞核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状,早期凋亡细胞核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状。染毒组早期凋亡细胞多于阴性对照组,随剂量增高,晚期凋亡细胞和死亡细胞也增多。不同剂量组间染毒24小时后,流式细胞术散点图可见,随染毒剂量增加,活细胞率逐渐下降,以200mmol/L剂量组的活细胞率最低。经单因素方差分析,空白对照组和各剂量组间早期凋亡细胞占细胞总数的百分率差异有统计学意义(F=8.299,P<0.01),随染毒剂量增高,早期凋亡细胞率增加。结论一定浓度的DMF能诱导正常成人离体肝细胞发生凋亡,其早期凋亡率有随DMF浓度的增高而增高的趋势。

扣针蛋白-5与疾病

扣针蛋白-5(fibulin-5,FBLN-5)是一个胞外基质糖蛋白,广泛分布于富含弹性蛋白的组织中,可通过与其它胞外蛋白相互作用而调节基质的结构.近期研究发现,该蛋白是一个内源性的血管生成抑制剂,在血管发育中发挥了重要的作用.同时,扣针蛋白-5与一些肿瘤的增殖、转移和侵袭等相关,其基因突变则会导致遗传性疾病的发生.本文就扣针蛋白-5与血管生成、血管发育、肿瘤及遗传性疾病的关系及当前的研究进展进行综述.

真核生物mRNA降解途径

mRNA降解在真核生物的基因表达调控中发挥重要作用.目前,已经鉴定了多种参与mRNA降解的酶和复合物,并发现细胞质处理小体可能是降解mRNA的主要位点.本文着重总结了正常和异常mRNA降解的主要途径以及各途径相关因子和酶的功能,并讨论了细胞质处理小体在mRNA降解过程中的作用.最后对该领域今后的研究重点和方向作了探讨.

血管生成素相互作用蛋白质的筛选与鉴定

血管生成素(angiogenin,ANG)在肿瘤、神经退行性疾病和先天免疫过程中均发挥作用,但对其具体生理病理功能和作用机制的了解并不深入全面.蛋白质-蛋白质相互作用调控着细胞内的各个生物学过程,可以为目标蛋白质功能和机制的探索提供信息.本文利用酵母双杂交技术,分别从人心肌和肝c DNA文库中筛选了ANG的可能相互作用蛋白质.对筛选获得的20个候选蛋白质进行生物信息学分析,显示10个蛋白质含有EGF结构域;有5个蛋白质在KEGG数据库已有记录,主要参与细胞黏附、通讯和迁移等过程.在以往的研究中,我们已经验证α-辅肌动蛋白2(α-actinin 2)、卵泡抑素(follistatin)、磷脂混杂酶1(phospholipid scramblase 1)和腓骨蛋白1(fibulin1)与ANG作用的真实性.本文的蛋白质沉降实验显示,ANG与腓骨蛋白2、3、4之间也存在相互作用.

血管生成素专刊序言

血管生成素（angiogenin）是1985年发现的．为展示30年来血管生成素相关领域研究进展，加强对血管生成素功能、作用机制及其与疾病关系的认识和理解，《中国生物化学与分子生物学报》在第7届编辑委员会成立之际委托我组织专刊．本期专刊包括9篇综述、4篇研究报告及1篇技术与方法方面的论文．

某高压开关柜生产企业职业病危害控制效果评价

目的评价某高压开关柜生产企业职业病危害控制效果。方法采用职业卫生现场调查、职业卫生检测、检查表法和职业健康检查等方法进行综合评价。结果该企业职业病危害因素主要是化学毒物、粉尘和噪声。化学毒物检测全部低于职业接触限值;粉尘检测中硫化喷涂岗位,时间加权平均浓度低于职业接触限值,而短时接触浓度高于职业接触限值;噪声监测显示4个点超过卫生限值。结论该建设项目职业病危害因素的防护措施基本可行。

真核生物rRNA基因的转录调节

核糖体RNA(rRNA)基因的转录直接决定着细胞核糖体的生物发生,而后者与细胞的生长、增殖等行为相适应.研究发现,rRNA基因转录以RNA聚合酶Ⅰ(Pol Ⅰ)为核心,有多种因子参与,并受到多种调控因子的严密调节控制;各调控因子不仅均有自己特异的作用位点,而且又彼此关联、相辅相成.本文在简要介绍真核生物rRNA基因转录基本过程与涉及的主要因子的基础上,重点阐述了rRNA基因转录的主要调节方式,包括ERK、mTOR和JNK等信号转导通路对转录因子磷酸化的影响;转录因子的乙酰化;细胞周期相关因子和其它因子的多种作用方式等.概括起来看,真核生物rRNA基因转录调节的核心机制是调节转录因子间及转录因子与DNA间的相互作用或影响染色质结构,从而实现对rRNA基因转录的调控,以满足特定生理/病理状况下细胞对rRNA量的要求.

利用人口流动数据以及两阶段模型预测2019冠状病毒病流行趋势

目的:基于人口流动和疫情防控措施信息构建数学模型,预测2019冠状病毒病(COVID-19)疫情的发展趋势。方法:获取截至2020年2月8日浙江省乐清市151例确诊病例的患病过程以及乐清和武汉之间的人口流动等信息,采用两阶段的方法构建数学模型,将人口流动数据与确诊病例症状开始时间以及输入性病例和本地病例的传播动力学特征整合起来,模拟并预测乐清的COVID-19疫情发展趋势。结果:在疫情初期,每日从武汉来的输入性病例数(症状出现日)与当日、6 d前和9 d前从武汉到乐清的旅客数量成正相关。利用根据武汉到乐清的旅客数量估计的输入性病例数以及易感-暴露-感染-恢复模型预测乐清最终的病例数为170例。如果根据每日报告的输入性病例数来预测,预计最终病例数为165例。截至2020年4月27日,乐清实际监测到的病例数为170例,这两个预测值与实际值均接近。结论:本研究建立的两阶段预测模型能够对COVID-19的流行趋势做出准确预测。

核糖核酸酶5在宿主防御中的作用及机制

抗菌肽是机体天然免疫的重要组成部分。核糖核酸酶5 (ribonuclease5,RNASE5;又名angiogenin)属于核糖核酸酶A超家族,是一个分泌型小分子蛋白质,广泛分布于机体需要抵御外界病原微生物的组织中。RNASE5对病毒、细菌以及真菌都存在抑制效应,具有广谱抗菌特点,但其表达和活性受到宿主生理状态和外界环境多层次的调控。RNASE5存在多样的抗微生物作用机制,其带正电荷的理化特性破坏微生物细胞壁,而其核糖核酸酶活性则是杀伤真菌所必须的。除了直接作用于微生物外,RNASE5还可作为重要因子调节宿主免疫功能,参与多种病理过程。本文综述了RANSE5的结构、生物活性与功能、作用特点与机制,并讨论了在其研究中存在的问题,以期为今后的研究提供新思路和新方向。

血管生成素:RNA代谢过程中重要的核糖核酸酶

血管生成素是核糖核酸酶A超家族成员之一,具有较弱的核糖核酸酶活性.最新研究发现,血管生成素参与细胞内多种RNA的代谢过程.在生长条件下,血管生成素可以发生核转位聚集于细胞核中,促进rRNA转录,并可参与其剪切加工,同时它也调控一系列mRNA基因的转录,最终促进细胞的生长和增殖;在应激条件下,血管生成素能降解tRNA形成tiRNA,抑制细胞内整体蛋白质的翻译水平,并促进应激小体的形成,激活细胞内应激保护机制,从而促进细胞存活.此外,血管生成素还可参与非编码小RNA等RNA代谢过程.本文概述了血管生成素在RNA代谢中的作用与分子机制等方面的进展,并探讨了其在疾病发生和发展中的作用,以期开拓血管生成素的研究新思路.

血管生成素基因组结合序列的筛选与鉴定

血管生成素(angiogenin,ANG)调控细胞增殖、迁移、分化等生物学过程,但其作用的分子机制尚未完全明了.目前认为,ANG可结合到r DNA区域促进r RNA转录,也可能与m RNA有结合.为全面鉴定细胞内可结合ANG的基因组序列,我们利用染色质免疫共沉淀结合DNA芯片技术(Ch IP-chip)对He La细胞的基因组DNA进行了筛选,共获得了1 248个结合片段.我们进一步分析了这些结合片段附近分布的基因,发现有699个可能受ANG结合调控的基因.基因注释和聚类分析显示,这些可能受ANG调控的基因主要与肿瘤发生发展有关(特别是结直肠癌和前列腺癌),并且与TGF-β和Wnt信号通路相关.最后,我们验证了ANG不仅与WNT6、CCNE1、APC2、FZD8和EGFR基因的启动子区域有直接结合,而且调控其表达.以上研究结果为深入研究ANG的功能机制提供了线索.