人细胞色素P450 1A1与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白及其抗体的制备

采用融合蛋白技术原核表达 CYP1 A1 (第 2 4 1- 381个氨基酸 )与谷胱甘肽 S-转移酶 (GST)的融合蛋白作为抗原 ,用于制备 CYP1 A1多克隆抗体 .根据正反重组质粒 p GEX/ 1 A1表达的融合蛋白大小不同的原理 ,直接表达筛选得到正向重组质粒p GEX/ 1 A1 .通过优化表达条件 ,提高了目的蛋白的表达水平 .包涵体蛋白经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离 ,获含纯化融合蛋白 GST- 1 A1的 PAGE凝胶 .直接用含 GST- 1 A1的凝胶悬液免疫 BALB/ c小鼠 ,自腹水中获取 CYP1 A1多克隆抗体 (1 A1 p Ab) . 1 A1 p Ab用切胶纯化的融合蛋白GST- 2 B6交叉吸收 ,蛋白 A- Sepharose亲和层析柱来纯化 .用切胶纯化的融合蛋白 GST- 1 A1及 GST-2 B6的免疫印迹反应初步鉴定 1 A1 p Ab的特异性 .纯化的 1 A1 p Ab对融合蛋白 GST- 1 A1反应特异性较强 ,但仍对 GST- 2 B6有弱交叉反应 .

人细胞色素P450 1A2 cDNA克隆及鉴定

为建立人细胞色素 P450转基因细胞 ,从人肝组织提取总 RNA,RT- PCR扩增人细胞色素 P4501 A2基因的 c DNA( CYP1 A2 c DNA) ,将其连接到p GEM- T载体上 ,并对 CYP1 A2 c DNA进行全序列测定 .结果与 Jaiswal等发表的 CYP1 A2 c DNA序列相比 ,所克隆的 c DNA,codon51 5AAT→ AAC都编码天冬酰胺 ,而 codon 51 0后面插入了一个CTG(亮氨酸 ) ,则与 Quattrochi等报道的相同 .本实验室克隆的 CYP1 A2 c DNA可能是一种新的CYP1 A2 c DNA,有可能来自于一种新的 CYP1 A2等位基因的转录 .

一种新的人细胞色素P450 2A6 cDNA克隆

目的 :克隆人细胞色素P45 0 2A6cDNA。方法 :用逆转录 -PCR和DNA重组技术 ,从人肝组织中扩增人细胞色素P45 0 2A6基因的cDNA ,并将其连接到pBluescript载体上 ,对CYP2A6cDNA进行全序列测定。结果 :所克隆的cDNA与Yamano等发表的CYP2A6cDNA序列相比 ,在编码区有两个变异 ,即codon 8CTG→TTG ,编码的氨基酸不变 ,为亮氨酸。codon479GGC(甘氨酸 )→GTC(缬氨酸 ) ,其余均相同。而在其 3′端非编码区变异很多。与Fernandez -Salguero等报道的CYP2A7序列相比 ,其 5′端虽与所克隆的CYP2A6有较多差异 ,但其codon479也是GTC(缬氨酸 ) ,在 3′端非编码区仅略有差异。而所克隆的CYP2A6cDNA与Yamano等报道的CYP2A7序列相比 ,3′端非编码区至所设PCR引物止 ,所克隆的基因序列完全相同 ,而在编码区却差异较多。结论 :本实验室克隆的CYP2A6cDNA是一种新的CYP2A6cDNA序列 。