两种不同淋巴转移能力小鼠肝癌细胞亚系的建立和生物学特性

通过单细胞分离(克隆)培养和局部淋巴结转移灶筛选的方法,建立两种不同淋巴转移能力HepA肝癌细胞亚系,分别命名为HepA-H和HepA-L,并比较其生长、游走和贴壁能力等生物学特性。瘤细胞接种于小鼠足垫后,同侧腘窝淋巴结转移率,HepA-H为83.3%,HepA-L为16.7%,两者具有显著差异(p<0.01)。两种细胞亚系均未见肺、肝、脾、肾等脏器转移灶。体外实验显示,HepA-H的生长、游走和贴壁能力均强于HepA-L。HepA肝癌不同淋巴转移能力亚系的建立,为研究肿瘤经淋巴管转移机理提供了良好的肿瘤淋巴转移动物模型。

羊栖菜多糖诱导HL-60细胞凋亡的研究

用MTT法观察羊栖菜多糖(SFPS)在体外抗人白血病HL-60细胞增殖作用;扫描电镜、透射电镜、DNA电泳和流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡。结果表明SFPS对HL-60细胞具有显著生长抑制作用,并呈量效和时效关系,药物作用24,36,48,72h的IC_(50)分别为390,362,402,421mg/L;药物浓度为300mg/L和500mg/L作用HL-60细胞后,琼脂糖凝胶电泳显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带,细胞微绒毛减少、染色质固缩、过集,凋亡小体形成;DNA直方图出现亚G_1峰。在一定浓度范围内,SFPS诱导细胞凋亡的作用呈现浓度和时间依赖性,同时G_2/M期细胞比例增多。因此,SFPS抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡和G_2/M期细胞阻滞有关。

天花粉蛋白对HepA-H细胞和HeLa细胞抑癌活性研究

目的比较分析商品天花粉蛋白(TCS1)和从鲜药材中提取分离出的天花粉蛋白粗品(TCS2),对HepA-H细胞(腹水型肝癌高转移株细胞)和HeLa细胞(人宫颈癌肿瘤细胞)的杀伤作用,并进一步探讨其抑癌作用机理。方法MTT法检测药物的细胞毒作用,电镜观察细胞超微结构改变,电泳检测细胞DNA生物化学特征改变。结果TCS1和TCS2对HepA-H细胞作用不明显(P>0.05),而对HeLa细胞具有显著性作用,呈明显时效、量效关系(r>0.864,P<0.05或P<0.01)。在相同作用时间内,TCS2作用组对细胞生长抑制率均高于TCS1组(P<0.01)。进一步研究发现,HeLa细胞经TCS2作用后,细胞表面微绒毛消失,胞膜发泡,核染色质浓缩边集,并出现凋亡小体,细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳呈典型的梯形带。结论HepA-H细胞对天花粉蛋白不敏感,而HeLa细胞对TCS1和TCS2敏感,其中TCS2抑癌活性明显强于TCS1,细胞生长受抑制作用显著,作用机制与诱导细胞凋亡相关。

栝蒌根提取物对Hela细胞作用的初步研究

目的:研究栝蒌根提取(简称栝蒌根)物体外对Hela细胞毒作用,探讨其抑癌作用机理。方法:用MTT法检测栝蒌根对Hela细胞毒作用,扫描电镜和透射电镜观察细胞超微结构变化,DNA琼脂糖凝胶电泳法检测其生化特征改变。结果:Hela细胞经栝蒌根作用24～48h后,细胞体外杀伤作用明显,呈量效、时效关系(r>0.880,P<0.01);电镜观察可见Hela细胞表面微绒毛明显减少或消失,胞膜发泡,细胞核固缩,核染色质浓缩边集,并出现凋亡小体;细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳可见典型的梯形带。结论:栝蒌根提取物对Hela细胞具有良好的抗癌活性,其作用机制与诱导细胞凋亡相关。

肝细胞癌nm23H1基因遗传不稳定性与临床病理特征的相关性研究

目的:研究人类17号染色体D17S396位点微卫星不稳定性和杂合性缺失,对肝细胞癌nm23H1蛋白表达的影响,阐明nm23H1基因遗传不稳定性与肝细胞癌及临床病理特征的关系,为揭示nm23H1基因作用机制和肿瘤发生、转移机理提供实验依据。方法:采用石蜡包埋组织抽提DNA,PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP),常规银染,Envision免疫组织化学和Leica-Qwin计算机图像分析等方法进行nm23H1基因遗传不稳定性研究。结果:①48例肝细胞癌D17S396位点遗传不稳定性的发生率为35.42%。LOH的发生率在有无淋巴结或远处转移和有无肝内转移或门静脉栓的癌组织中有显著差异(P<0.01),临床TNM分期Ⅲ期LOH的发生率显著高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.01)。此外,在侵袭转移高危组LOH的发生率显著高于侵袭转移低危组(P<0.01)。MSI检出率与肝细胞癌临床病理参数均无关。②nm23H1蛋白阳性率为56.25%,nm23H1蛋白阳性率在Edmondson分级Ⅲ+Ⅳ组低于Ⅰ+Ⅱ组(P<0.01),在有淋巴或远处转移组显著低于无淋巴或远处转移组(P<0.01),TNM分期Ⅲ期显著低于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.01);在侵袭转移高危组中nm23H1蛋白阳性率显著低于侵袭转移低危组(P<0.01)。此外,计算机图像定量分析显示,在各临床病理参数影响下,nm23H1蛋白的表达强度没有差异。③LOH阳性组中nm23H1蛋白阳性率为27.27%,显著低于LOH阴性组64.86%,两者差异显著(P<0.05)。结论:nm23H1基因的MSI和LOH通过相互独立的途径调控肝细胞癌的发生和转移,后者可抑制肝细胞癌局部nm23H1蛋白的表达,并赋予肝细胞癌高转移、预后差的特性。提高肝细胞癌局部nm23H1蛋白的表达,可减缓肿瘤的侵袭转移倾向,并改善预后。

靶向细胞周期蛋白B1的抗肿瘤研究

细胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)是有丝分裂期(M期)周期蛋白,与细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)结合形成成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF),MPF的激活为真核细胞启动有丝分裂所必需。CCNB1在肿瘤组织中普遍高表达,该蛋白质作为一种细胞周期进程调节剂在肿瘤细胞内的表达量是判断肿瘤恶性程度高低的指标之一,被视为肿瘤抗原,故靶向CCNB1进行抗肿瘤治疗是肿瘤基因治疗中一个极有潜力的策略。首先分析了CCNB1与肿瘤的相关性,进而从CCNB1活性抑制因子、药物或化合物对CCNB1的抑制作用及CCNB1与抗肿瘤免疫等多方面对靶向CCNB1的抗肿瘤研究进行了综述。

HepA-H和HepA-L肝癌荷瘤小鼠CD8^+/CD28^+T细胞和肿瘤新生淋巴管的研究

目的研究不同淋巴转移潜能肝癌(H epA-H和H epA-L)荷瘤小鼠体内CD 8+/CD 28+T淋巴细胞和肿瘤新生淋巴管,探讨与肿瘤淋巴转移的关系。方法用两种来源相同,而淋巴转移能力不同的小鼠肝癌细胞亚系,H epA-H(高淋巴转移)和H epA-L(低淋巴转移),小鼠皮下接种,制备荷瘤动物模型。采用抗小鼠CD 8、CD 28荧光标记单克隆抗体,流式细胞术定量检测小鼠外周血和肿瘤组织内CD 8+/CD 28+T淋巴细胞数量;应用5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶双重组化染色法,观察肿瘤新生淋巴管。结果肿瘤皮下接种后14天,H epA-H组荷瘤小鼠外周血CD 8+/CD 28+T淋巴细胞数量明显低于正常对照组(P<0.05);H epA-H组肿瘤组织内CD 8+/CD 28+T淋巴细胞数量显著低于H epA-L组(P<0.05)。两种肿瘤细胞亚系均可诱导肿瘤新生淋巴管,但H epA-H肿瘤内和瘤周最高淋巴管密度均明显高于H epA-L组(P<0.01)。结论肿瘤淋巴转移能力的差异与体内CD 8+/CD 28+T淋巴细胞数量及肿瘤新生淋巴管有关。

AS-CLB1增强泰素帝抗Lewis肺癌细胞体内外增殖作用的研究

目的:研究细胞周期蛋白B1反义全长cDNA(AS-CLB1)对抗Lewis肺癌细胞(LL/2)体内外增殖作用的影响,为将AS-CLB1联合用于人肺癌等恶性肿瘤的治疗提供实验依据。方法:(0.01nmol/L～0.1μmol/L)处理LL/2亲本(LP),LL/2空载体(LV)及LL/2/AS-CLB1(LA)三种细胞,分别于1h及24h后用MTT比色法评估对各组细胞的杀伤作用。将上述三种细胞分别接种C57BL/6小鼠,成瘤后用(15mg/kg.d)处理各组动物,3d1次,一共4次,进行成瘤性及动物生存时间观察;流式细胞仪检测各组动物肿瘤组织细胞周期及凋亡。结果:无论是泰素帝处理1h还是24h,LA细胞存活率较LP、LV两对照均明显降低(P<0.05);其中处理1h后,泰素帝80nmol/L组LA细胞存活率低于对照9倍以上,处理24h后,20nmol/L组LA细胞存活率低于对照7倍左右。LA组小鼠肿瘤体积明显小于对照(P<0.05),接种后30天,LP组肿瘤体积大小为1981.29±318.56mm3,LV组为1673.36±297.96mm3,LA组仅为421.68±30.16mm3。LA组肿瘤组织中细胞在G1期所占比例为(89.7±0.5)%,凋亡率为(79.5±1.2)%,均较对照明显增加(P<0.05)。接种后60天,LA组尚有70%的小鼠存活,LP组仅30%,LV组仅40%存活,LA组动物生存时间明显延长(P<0.01)。结论:AS-CLB1可以明显增强抗LL/2细胞在体内外的增殖作用,此增强效应可能与AS-CLB1诱导细胞发生G1期阻滞及凋亡,增强了抗肿瘤作用有关。

环境污染物对巨噬细胞的影响及生物监测意义

研究环境污染物亚硫酸盐和无机汞对小鼠腹腔巨噬细胞的影响,探讨巨噬细胞作为生物监测指示物的意义。实验取小鼠腹腔巨噬细胞分别经Na_2SO_3和HgCl_2体外培养,光镜和电镜下观察细胞形态学改变,检测其NO产量,还原MTT能力和吞噬功能。结果显示,小鼠腹腔巨噬细胞染毒后,细胞形态均发生显著改变;NO浓度明显降低,还原MTT能力受抑制,吞噬功能明显减弱(p<0.05或p<0.01)。高浓度(10^(-4)mol/L)HgCl_2细胞毒性作用显著,可致巨噬细胞坏死。实验表明,Na_2SO_3和HgCl_2对小鼠腹腔巨噬细胞具有明显损伤作用,进而直接影响巨噬细胞的非特异性防御功能。实验提示巨噬细胞可作为生物监测指示物,应用于环境污染的生物监测。

热疗联合一氧化氮供体硝酸异山梨酯诱导Hep-A细胞凋亡的研究

研究热疗联合硝酸异山梨酯(Isosorbide dinitrate,ISDN)体外诱导Hep-A细胞凋亡,并探讨其机理。本实验中,应用MTT法检测Hep-A细胞增殖抑制作用;扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪观察Hep-A细胞凋亡;Western blot法检测Bcl-2蛋白表达。结果显示,热疗组、ISDN组和热疗联合ISDN组对Hep-A细胞具有明显增殖抑制作用(p<0.05),热疗联合ISDN组的抑制作用较其他各组更显著(p<0.05);电镜观察可见细胞表面微绒毛明显减少或消失、胞膜发泡、细胞固缩和核染色质浓缩边集,并出现凋亡小体。在相同时间点,热疗联合ISDN组诱导Hep-A细胞凋亡率高于ISDN组和热疗组。各实验组均使Bcl-2蛋白表达下调。研究结果提示,热疗联合ISDN诱导Hep-A瘤细胞凋亡有协同作用,其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达有密切关系。

夏至草醇提物对大鼠淋巴循环作用的实验研究

目的探讨夏至草醇提物对淋巴循环的调节作用。方法采用淋巴微循环观察、淋巴引流及淋巴液流变学技术,观察夏至草醇提物对32只大鼠肠淋巴循环的作用。结果静脉推注夏至草醇提物后,在6 g.kg-1剂量时肠系膜淋巴管收缩频率及幅度均增大,3 g.kg-1剂量时收缩幅度也增加,均显著高于给药前及对照组(P<0.05);高剂量组的肠淋巴流量、蛋白输出量和淋巴细胞输出量明显高于给药前及对照组(P<0.05);中及高剂量组均能明显降低淋巴液黏度,但1 g.kg-1剂量对淋巴循环未发生影响。结论较大剂量夏至草醇提物具有增强淋巴管收缩性、淋巴液转运及降低淋巴液黏度的作用。

休克淋巴液对大鼠肺微血管内皮细胞的损伤作用

无菌条件下复制大鼠重症失血性休克模型,引流肠系膜淋巴液或收集门静脉血,同时,引流正常淋巴液、正常门静脉血。以不同处理因素与原代培养的第三代肺微血管内皮细胞(PMVEC)共同孵育,通过光镜、透射电镜、扫描电镜观察细胞形态及超微结构,MTT法检测不同终浓度的休克淋巴液及正常淋巴液对PMVEC增殖的影响;流式细胞仪检测PMVEC周期变化;同时进行细胞核DNA电泳分析。结果表明,休克淋巴液对PMVEC具有损伤作用,表现为细胞收缩、核固缩等,扫描电镜可观察到凋亡小体;随着休克淋巴液终浓度增加,PMVEC的增殖活力逐渐降低,显著低于正常淋巴液组;4%终浓度的休克淋巴液作用PMVEC 4h后,G0-G1期细胞比值增大,S+G2-M期细胞比值下降,其他处理因素无明显变化,同时细胞核DNA电泳形成典型的阶梯状电泳图谱(DNA ladder)。结果提示,休克淋巴液可导致PMVEC形态学及超微结构损伤,同时抑制细胞增殖、影响细胞周期、诱导细胞凋亡。

胃癌nm23H1 mRNA、VEGF-C mRNA表达及其与淋巴转移、生存率的相关性研究

研究胃癌组织nm23H1 mRNA、VEGF-C mRNA和VEGFR-3的表达与胃癌中的新生淋巴管的生成、肿瘤淋巴道转移和生存率关系,为临床治疗及预后提供实验依据。用胃癌与癌周组织作对照,应用原位杂交法检测78例胃癌组织nm23H1 mRNA、VEGF-C mRNA表达,并以VEGFR-3抗体为标记,经EnVisionTM免疫组织化学及Leica-Qwin计算机图像分析,用Weidner最高血管密度计数法,计数阳性淋巴管数(MLC),以及调查患者术后的生存率。胃癌nm23H1 mRNA阳性表达 69．23％(54例)、nm23H1 mRNA阳性表达与胃癌淋巴结转移、TNM分期、MLC呈负相关(P<0．01), VEGF-C mRNA阳性表达46．15％(36例),其与胃癌淋巴结转移、TNM分期、MLC呈正相关(P<0．01 或P<0．05)．与癌周组织的nm23H1 mRNA和VEGF-C mRNA表达比较,具有显著性差异(P<0．01 或P<0．05)。nm23H1 mRNA在Ⅰ、Ⅱ期胃癌中呈高表达,在Ⅲ、Ⅳ期患者中呈低或无表达。胃癌组织的MLC(8．37±2．29/mm2)显著高于癌周组织(4．51±2．64/mm2),两者比较具有显著性差异(P<0．05)。 nm23H1 mRNA与VEGFR-3表达之间存在负相关(P<0．05,r=0．8479);VEGF-C mRNA与VEG- FR-3表达之间存在正相关(P<0．05,r=0．8362)。在根治术5年内死亡的61．54％(48例)患者中 MLC(10.82±2．51/mm2)高于5年内生存的患者(6．53±2．09/mm2),两组间有显著性差异(P<0．05);在不同的肿瘤病理学分级中,胃癌未、低分化型与高、中分化型的nm23H1 mRNA阳性表达,有显著性差异(P<0．05),当nm23H1 mRNA高表达时,肿瘤淋巴转移率低,生存率高,故认为nm23H1基因具有抑制胃癌发生和淋巴道转移作用;当VEGF-C mRNA高表达时,肿瘤淋巴转移率高,生存率低。胃癌组织中的VEGFR-3表达水平与肿瘤的淋巴转移密切相关,胃癌组织MLC的显著增高,提示肿瘤组织有新淋巴管的生成。VEGF-C促进了肿瘤诱导的淋巴管新生,在胃癌的淋巴道转移中起重要作用。

前列腺癌nm23H1mRNA、TGF-β1mRNA表达及其与肿瘤转移、生存率的相关性研究

应用原位杂交法检测42例前列腺癌组织nm23H1mRNA、TGF-β1mRNA表达,并以CD31抗体为标记,经EnVision^(TM)免疫组织化学及Leica-Qwin计算机图像分析,用Weidner最高血管密度计数法,计数阳性MVD,研究前列腺癌组织nm23H1mRNA、TGF-β1mRNA和CD31的表达与前列腺癌中的新生血管的生成、肿瘤血道转移和调查患者术后的生存率关系。前列腺癌nm23H1mRNA阳性表达66．67%(28例),nm23H1mRNA阳性表达与前列腺癌骨转移、TNM分期、MVD呈负相关(P＜0．05)：TGF-β1mRNA阳性表达78．75%(33例),其与前列腺癌骨转移、TNM分期、MVD呈正相关(P＜0．05),与癌周组织的nm23H1mRNA和TGF-β1mRNA阳性表达比较,具有显著性差异(P＜0．01或P＜0．05)。前列腺癌组织的MVD(78．51±10．29/mm^2)显著高于癌周组织(34．19±9．27/mm^2),两者比较具有显著性差异(P＜0．05)。在根治术后5年内死亡的42．86%(18例)患者中MVD(92．41±15．42/ mm^2),高于5年内生存的患者(62．79±13．58/mm^2),两组间有显著性差异(P＜0．05)；在不同的肿瘤病理学分级中,nm23H1mRNA在前列腺癌未、低分化型中阳性表达率高,高、中分化型中阳性表达率低,两组间有显著性差异(P＜0．05)。当nm23H1mRNA阳性表达率高时,肿瘤骨转移率低,生存率高,故认为nm23H1基因具有抑制前列腺癌发生和转移作用。当TGF-β1mRNA阳性表达率高时,肿瘤骨转移率高,生存率低。故认为TGF-β1基因具有促进前列腺癌发生和转移作用。前列腺癌组织中的MVD与肿瘤骨转移密切相关,前列腺癌组织MVD的显著增高,提示肿瘤组织有新血管的生成。TGF-β1促进了肿瘤诱导的血管新生,在前列腺癌的骨转移中起重要作用。

天花粉蛋白抑制HeLa细胞生长及诱导细胞凋亡之机制探讨

目的研究天花粉蛋白(TCS)对人宫颈癌HeLa细胞生长抑制作用及其机制,探讨HeLa细胞凋亡发生的分子机制。方法采用CCK-8的方法,检测TCS对HeLa细胞的抑制作用;流式细胞仪检测TCS对细胞周期的影响;电子显微镜和Annexin法观察TCS对HeLa细胞诱导凋亡的作用;应用Western blotting观察HeLa细胞caspase-3酶原的变化;用caspases活性检测试剂盒,检测caspase-3,8,9的活性。结果1.TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用;2.TCS可以将HeLa细胞阻滞于S期;3.TCS诱导HeLa细胞发生凋亡,HeLa细胞出现典型的凋亡特征———染色质浓缩和凋亡小体,且凋亡率具有时间依赖性;4.caspase-3酶原表达的降低呈现时间和浓度依赖性,而caspase-3活性随时间依赖性的增高,提示在TCS诱导HeLa细胞凋亡的过程中caspase-3被激活;5.caspase-8,9的活性增高,有时间依赖性,且具有时间顺序。100 mg/L TCS处理24h后,caspase-8早于caspase-3被激活,提示活化的caspase-8可能对caspase-3起到激活作用。结论TCS对HeLa细胞的抑制作用是通过将HeLa细胞阻滞于S期和诱导细胞凋亡来实现的。caspase-3的激活是介导TCS诱导HeLa细胞发生凋亡的通路,同时,活化的caspase-8,9可能参与了caspase-3的激活和凋亡的诱导。

TGF-β/BMPs、Wnt和MAPK信号通路在间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种多潜能成体干细胞,具有向成骨细胞分化的能力。在MSCs向成骨细胞分化中,受到多种信号通路调控,其中TGF-β/BMPs、Wnt、MAPK信号通路发挥了重要作用。而且,通过对Smad1蛋白酶体的调节,Wnt和MAPK信号可以对TGF-β/BMPs通路进行调控。在相关信号通路的共同作用下,MSCs向成骨细胞分化。现对MSCs分化过程中TGF-β/BMPs、Wnt、MAPK这三条通路进行了简要综述。

中国人卵巢上皮性肿瘤nm23H1基因遗传不稳定性的研究

采用石蜡包埋组织抽提DNA,PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP),常规银染、Envision免疫组织化学染色和Leica-Qwin计算机图像分析等方法,研究人类17号染色体D17S396位点微卫星不稳定(microsatellite instablility,MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH),对卵巢上皮性肿瘤nm23H1蛋白表达的影响,阐明nm23H1基因遗传不稳定性与卵巢肿瘤进展的关系,为揭示nm23H1基因作用机制和肿瘤转移机制提供实验依据。本实验中,卵巢上皮性癌D17S396位点遗传不稳定发生率为40%,明显高于交界性肿瘤的9.52%,而在良性肿瘤和正常卵巢组织中,未见该位点遗传不稳定的发生。其中,LOH的发生率,随肿瘤恶性程度的增高而增加(P<0.05)。在卵巢上皮性癌中,淋巴转移组的LOH发生率高于无淋巴转移组(P<0.01)。FIGO Ⅲ+Ⅳ期的LOH发生率高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)。MSI发生率与卵巢上皮癌组织类型、分化程度、淋巴转移及FIGO分期均无关。nm23H1 蛋白阳性率在卵巢上皮性癌和交界性肿瘤组织中分别为56.00%和57.14%,高于良性肿瘤的13.64%和正常卵巢组织的8.33%(P<0.01)。卵巢上皮性癌中,淋巴转移组nm23H1蛋白阳性率低于无淋巴转移组;FIGO Ⅲ+Ⅳ期nm23H1蛋白阳性率低于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)。此外,计算机图像定量分析显示,在各临床病理参数影响下,nm23H1蛋白的表达强度没有差异。在卵巢上皮性癌中,LOH阳性组中nm23H1蛋白阳性率为0.00%,显著低于LOH阴性组的73.68%(P<0.01)。实验结果提示, nm23H1基因的遗传不稳定性可能是卵巢上皮性癌发生、发展的一个重要机制。LOH的发生可作为卵巢组织恶变的判断指标。nm23H1基因的MSI和LOH,通过相互独立的途径调控卵巢上皮癌的发生和转移,后者可抑制卵巢上皮癌局部nm23H1蛋白的表达,并赋予卵巢上皮癌高淋巴结转移、低预后的特性。提高卵巢上皮癌局部nm23H1蛋白的表达,可减缓肿瘤的淋巴转移并提高预后率。

休克淋巴液诱导大鼠肠系膜微淋巴管内皮细胞凋亡

无菌条件下复制大鼠重症失血性休克模型,引流肠系膜淋巴液或收集门静脉血,同时,另取动物引流正常淋巴液、正常门静脉血。以不同处理因素与第3代原代培养的肠系膜微淋巴管内皮细胞(MMLEC)共同孵育,MTT法检测不同终浓度的休克淋巴液及正常淋巴液对MMLEC增殖的影响;流式细胞仪检测MMIEC增殖周期变化、并进行细胞核DNA电泳分析;RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2、bax及fas、fas L的表达。结果表明,随着休克淋巴液终浓度增加,MMLEC的增殖活力逐渐降低,显著低于正常淋巴液组;4%终浓度的休克淋巴液作用MMLEC 4h后,MMLEC凋亡率为(35.4±1.6)%,C_0-G_1期细胞比值增大,S+G_2-M期细胞比值下降,其它处理因素无明显变化,同时细胞核DNA电泳形成典型的阶梯状电泳图谱(DNA ladder)。4%终浓度的休克淋巴液作用4h后,显著高于其它各组(P<0.01);4%终浓度的休克淋巴液作用6h后,MMLEC的fas、fas L、bax mR- NA表达高于其它组、bcl-2 mRNA表达低于其它组(P<0.01)。结果提示,休克淋巴液可抑制MM- LEC增殖、干扰细胞周期、上调凋亡促进基因表达.从而诱导细胞凋亡。

肠淋巴途径在二次打击大鼠肺组织细胞凋亡中的作用

目的:观察结扎肠系膜淋巴管对二次打击大鼠肺组织细胞凋亡、凋亡相关基因以及TNF-α、IL-6水平的影响。方法:雄性Wistar大鼠45只,均分为结扎组、未结扎组、假手术组,以失血、LPS复制二次打击模型,结扎组行肠系膜淋巴管结扎术。在手术创伤后24 h,选择肺固定位置制作切片,TUNEL法检测细胞凋亡率,免疫组化法检测Bcl-2和Bax蛋白表达;并制备肺组织匀浆,ELISA法检测血清、肺匀浆TNF-α、IL-6。结果:二次打击后,未结扎组肺组织细胞凋亡率、Bax表达、血清及肺匀浆TNF-α、IL-6明显高于假手术组及结扎组,Bcl-2表达显著低于假手术组及结扎组(P<0.01,P<0.05),细胞凋亡以上皮细胞为主;结扎组肺组织细胞凋亡率与假手术组比较无显著差异(P>0.05),肺组织Bcl-2表达显著增高,Bax表达显著低于假手术组(P<0.01,P<0.05)。结论:阻断肠淋巴途径可减轻失血-LPS致大鼠肺组织细胞凋亡,其机制可能与肠系膜淋巴管结扎降低促细胞凋亡介质TNF-α、IL-6水平、提高Bcl-2表达有关。提示二次打击的肠源性淋巴液在大鼠急性肺损伤的发病过程中发挥着重要作用。

散发性胆囊癌nm23-H1基因遗传不稳定性与错配修复基因hMLH1和hMSH2蛋白表达的研究

目的:研究人类17号染色体D17S396位点微卫星不稳定性和杂合性缺失,对nm23-H1蛋白表达的影响,同时检测错配修复基因hMLH1和hMSH2蛋白的表达,为揭示nm23-H1基因、hMLH1和hMSH2基因与肿瘤发生和转移机制提供实验依据。方法:采用石蜡包埋组织抽提DNA、PCR-SSCP、常规银染、Envision免疫组织化学等方法,对50例胆囊癌及其相应的正常组织,进行D17S396位点MSI、LOH的检测和nm23-H1、hMLH1和hMSH2蛋白表达研究。结果:①原发性胆囊癌D17S396位点遗传不稳定发生率为42.55%,LOH的发生率与肿瘤组织分化程度差异显著(P<0.05);在肝脏侵润和淋巴转移组高于无肝脏侵润和无淋巴转移组(P<0.01),在Ne-vinⅣ+Ⅴ期高于Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期(P<0.01);而MSI发生率则相反;②nm23-H1蛋白阳性率为46.81%,在淋巴转移组低于无淋巴转移组(P<0.01);NevinⅣ+Ⅴ期低于Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期(P<0.05);③hMLH1和hMSH2蛋白阳性率分别为51.06%和42.55%,hMLH1蛋白表达在有无淋巴转移组和Nevin分期有显著差异(P<0.01),肝脏侵润组低于无肝脏侵润组(P<0.05);④MSI阳性组中hMLH1蛋白阳性率显著高于MSI阴性组(P<0.05)。LOH阳性组中nm23-H1和hMSH2蛋白阳性率显著低于LOH阴性组(P<0.05);⑤hMSH2蛋白阳性组中nm23-H1蛋白表达明显高于hMSH2蛋白阴性组(P<0.05)。结论:nm23-H1基因的遗传不稳定性可能是胆囊癌发生、发展的一个重要分子机制。nm23-H1基因的MSI和LOH,通过相互独立的途径调控胆囊癌的发生和转移。hMLH1/hMSH2表达异常可能是胆囊癌的早期分子事件。提高胆囊癌局部nm23-H1、hMLH1和hMSH2蛋白的表达,可减缓肿瘤的侵润转移并提高预后率。