汉坦病毒疫苗株Z10与Z37重组核蛋白NP的表达纯化及其特异结合基因组末端反向重复序列的功能研究

汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒型肺炎综合征(HPS)的主要病原体。其基因组由三节段的单股负链RNA组成,即S、M与L基因片段。汉坦病毒基因组的一个重要特点是每个基因片段的两个末端都有一段长18个核苷酸的高度保守的反向重复序列,互补可形成双链发夹结构,并且这一特点为不同型病毒所共有。为了研究该基因组末端保守的反向重复序列的功能,首先构建了汉坦病毒中国疫苗株Z10(汉滩型)及Z37(汉城型)的核蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达。经NI NAT亲和柱和HiPrep16/10DEAE离子交换柱液相色谱(FPLC)二步提纯,获得高纯度的重组核蛋白,并分别以胰蛋白酶消化后,用Westernblotting进行区分和鉴定。以T4DNA激酶同位素标记一对人工合成互补的18个核苷酸反向重复序列,制备双链探针。然后将该探针与纯化的Z10、Z37株的核蛋白NP进行非变性凝胶电泳迁移改变实验(EMSA)后发现,重组的Z10、Z37株的核蛋白NP,在体外均可特异地结合其基因组末端反向重复序列形成的双链探针。该结果表明,汉坦病毒基因组末端的反向重复序列是核蛋白重要结合位点,这对理解汉坦病毒核蛋白功能以及病毒复制过程中病毒粒子的包装机制有重要的意义。

反转录病毒MSCV介导汉坦病毒核蛋白基因在NIH3T3细胞中整合和表达

汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒型肺炎综合征(HPS)的主要病原体。由S基因编码的核蛋白(NP)主要与机体的细胞免疫有关,并调节病毒的复制及诱导细胞程序性死亡。构建了汉坦病毒Z10株核蛋白cDNA与含有pac基因的反转录病毒鼠干细胞病毒(MSCV)重组体MSCV-FlagNP,通过磷酸钙转录法导入产病毒的包装细胞系BOSC23中,产生完整的重组MSCV-FlagNP病毒。然后以重组病毒感染NIH3T3细胞,利用Puromycin的选择特性(pac基因)对感染细胞进行连续压力筛选,获得了转核蛋白抗性细胞。利用Southernblot和PCR方法分别对核蛋白基因在抗性细胞染色体整合情况及其完整性进行了鉴定。并且用Westernblot在抗性细胞中可检测到核蛋白的表达。进一步以Flag单克隆抗体介导的免疫荧光染色联合共聚焦激光扫描荧光显微镜,分析了内源性Flag融合核蛋白在抗性细胞内分布,发现核蛋白主要分布于胞浆及胞核周围区,并且部分核蛋白可聚集形成胞浆包涵体。转核蛋白基因细胞模型的建立,对进一步研究汉坦病毒核蛋白功能以及病毒复制机制有重要意义。

静脉药瘾者人类免疫缺陷病毒核酸测定及亚型分析

目的 了解静脉药瘾者人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染情况及感染亚型 ,追踪传染源 ,预测未来流行株。方法 对 1997年从新疆至杭州的 15例静脉药瘾者血清进行抗 HIV的初步筛选 ,结果为阳性者再行免疫印迹 (Westernblot)、套式聚合酶链反应 (Nest PCR)及HIV核酸序列分析。结果15例新疆籍静脉药瘾者均感染了HIV 1,其中有 2例为E亚型 ,其余均为C亚型。结论 静脉吸毒者主要感染HIV 1C亚型。我国HIV 1主要流行株可能已经发生变化。