DNA疫苗及其在病毒性传染病中的应用

DNA疫苗是基因治疗研究领域发展起来的第三代疫苗,其导入机体后可诱导有效的体液免疫及细胞免疫应答,是一类优点多、作用持久并兼有免疫防御及治疗作用的新型疫苗,本文就DNA疫苗的研究近况及其在病毒性传染病中的应用进行综述。

麻疹疫苗免疫持久性研究──初免后24-25年追踪观察

目的 对1973年在浙江省诸暨县（市）建立的麻疹免疫持久性观察基地进行麻疹疫苗初免后24～25年的血清抗体追踪观察。方法 对各年份血清学资料完整的326名观察对象采集微量血，测定HI抗体，同时对HI＜1：2的对象用细胞中和法（SN）进行复测。结果 初免后24-25年抗体阳性率为53．66%-84．48%。不同剂量免后HI的GMT和累积阴转率差异无显著意义。不同免疫途径免疫的抗体持久性均与野病毒感染基本一致，但HI＜1：2者用SN法复测抗体阳性率可达92．23%。结论 麻疹疫苗HI抗体阳性率随免疫时间推移降低，但细胞中和抗体阳性率仍较理想。

脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的 :探讨乙型肝炎病毒 (HBV) s基因和 c基因特异性的脱氧核酶 (DNAzyme)对 HBV表面抗原 (HB-s Ag)和 e抗原 (HBe Ag)表达的抑制效应。方法 :设计合成针对 HBV s基因 ORF A157UG、e基因 ORF A1816UG的DNAzyme Drz BS、Drz BC,在 2 .2 .15细胞上观察其对 HBV s基因、c基因的表达抑制效应。结果 :Drz BS、Drz BC作用于 2 .2 .15细胞后 ,可显著抑制 HBV s基因、c基因的表达 ,有效浓度为 0 .1～ 2 .5μmol/ L并呈剂量依赖性 ,最高抑制率分别为 94 .2 %和 91.8% ;有效抑制持续时间可达 72 h;Drz BS、Drz BC在细胞内对 Hbs Ag、Hbe Ag表达的抑制效率 ,明显高于作为对照的反义寡核苷酸 As BS、As BC,有效浓度较后者低至少 10倍。其对 2 .2 .15细胞的 HBVDNA复制无明显影响 ,亦未见明显的细胞毒性作用。结论 :在 2 .2 .15 HBV细胞模型系统 ,Drz BS、Drz BC能高效阻断 HBV s基因、e基因的表达 ,是一种特异性的、高效的抗 HBV基因治疗剂。

亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌同源性及碳青霉烯酶研究

目的明确我院临床分离亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌的耐药性、同源性及碳青霉烯酶基因型。方法收集我院2003年8月-2004年12月分离的95株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌。琼脂稀释法和E试验法测定15种抗菌药物的MIC值；脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株的同源性；PCR扩增及克隆测序分析碳青霉烯酶基因型；接合试验、质粒抽提及Southern杂交完成亚胺培南耐药基因定位。结果95株鲍曼不动杆菌对氨苄西林-舒巴坦、头孢哌酮-舒巴坦两个含舒巴坦制剂耐药率分别为67．9%、30．2%,对多黏菌素E耐药率最低,为17%,对其他抗菌药物的耐药率均在90%以上。95株鲍曼不动杆菌分离自10个临床科室,均产OXA-23碳青霉烯酶,PFGE分型共分为6型,以A、B型为主。碱裂解法反复抽提均未得到质粒,多次接合试验未成功。Southern杂交证实A、B克隆的oxa-23耐药基因位于细菌染色体约220 kb、200 kb大小的Apal酶切片段上。结论产OXA-23型碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌已成为我院医院感染的重要病原菌,在我院多个科室播散,且以A、B克隆为主。oxa-23耐药基因位于染色体上。

日本血吸虫病兔肝纤维化胶原合成与降解转录水平的研究

目的 从转录水平研究日本血吸虫病兔肝纤维化形成过程中胶原的合成与降解。方法 以日本血吸虫尾蚴感染新西兰兔形成肝纤维化动物模型 ,分别于感染后第 4、6、8、10、12、16、2 0、2 4和 2 8周手术取肝脏组织 ,用RT PCR加dotblotting法检测肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原以及降解胶原的基质金属蛋白酶MMP 1和MMP 9的mRNA水平 ,并进行肝组织病理学检测 ,观察虫卵肉芽肿大小和肝纤维化程度的变化。结果 在兔感染血吸虫初期 ,肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原及MMP 1、MMP 9的mRNA水平均上升 ,在感染后第 10周达到峰值 ,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和Ⅳ型胶原mRNA水平分别是正常水平的 12 0、11 0和 6 6倍 ,MMP 1和MMP 9mRNA水平分别是正常水平的 10 0和 11 0倍 ,与虫卵肉芽肿反应变化一致。其后胶原和胶原酶mRNA均下降 ,至第 2 8周 ,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和Ⅳ型胶原mRNA水平降至正常水平的 2～ 3倍 (P <0 0 5 ) ,而MMP 1和MMP 9mRNA水平接近正常 (P >0 0 5 )。显示血吸虫感染初期胶原合成与降解处于平衡状态 ,而感染后期胶原的合成多于胶原的降解。结论 从转录水平证实血吸虫病兔肝脏肉芽肿反应胶原合成大于降解 。

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞PD-L1表达的相关研究

目的:探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血树突状细胞(DCs)的PD-L1表达水平,及其对DCs刺激T细胞增殖的影响。方法:采集22例慢性HBeAg阳性CHB患者、8例急性恢复期乙型肝炎(AHB)患者和10例健康人(NC)的外周血,分离单个核细胞(PBMC)并诱导DCs的增殖和活化。相对荧光定量PCR测定DCs的PD-L1、PD-L2分子mRNA水平,流式细胞术测定DCs表面PD-L1和PD-L2的表达率。同时,测定外周血DCs刺激同种异体反应性T细胞增殖的能力,及抗PD-L1单抗对CHB组DCs刺激功能的影响。结果:体外成功诱导了外周血DCs的增殖和成熟。与NC组相比较,CHB组和AHB组患者外周血DCs内PD-L1的mRNA水平均显著增高(P均<0.05),但CHB组和AHB组间差异无统计学意义。CHB组患者外周血DCs表面PD-L1表达率较AHB组、NC组均有明显增高(P均<0.01)。而外周血DCs的PD-L2 mRNA水平及PD-L2在DCs表面的表达率在各实验组之间无明显差异(P均>0.05)。CHB组外周血DCs刺激T细胞增殖的功能较AHB组和NC组明显降低(P均<0.01),抗PD-L1抗体能显著增强CHB患者DCs刺激T细胞反应的能力。CHB患者外周血DCs表面PD-L1表达率与血清HBV病毒载量成正相关(r=0.34,P=0.007)。结论:外周血DCs表面PD-L1表达水平在慢性HBeAg阳性乙肝患者明显升高,抗PD-L1抗体可有效增强CHB患者外周血DCs刺激T细胞增殖反应的能力,表明PD-L1的高表达可能与T细胞免疫反应低下和HBV病毒高复制密切相关。

慢性乙型肝炎患者血清Ⅲ型前胶原、Ⅲ型胶原的前胶原氨端肽原的比较研究

比较慢性肝炎患者血清Ⅲ型前胶原（ＰＣⅢ）与Ⅲ型胶原的前胶原氨端肽原（ＰⅢＮＰ）对诊断肝纤维化的实用价值。对１１４例肝穿病理诊断的慢性肝炎轻、中、重度患者，同时进行血清ＰＣⅢ及ＰⅢＮＰ的检测，均用放射免疫法。肝穿刺标本病理组织学检查，作肝炎症活动度分级、肝纤维化程度分期及慢性肝炎病理组织学分度，探讨ＰＣⅢ及ＰⅢＮＰ与它们关系。１１４例轻、中、重度慢性肝炎患者，ＰＣⅢ与ＰⅢＮＰ之间均有明显差异（Ｐ＜０．０１）。这２项指标均与肝脏炎症活动度分级、肝纤维化程度分期及慢性肝炎的病理组织学分度有关。相关系数ＰＣⅢ为０．４４６、０．４１２和０．３４３；ＰⅢＮＰ为０．４６３、０．４０３和０．３０８。ＰＣⅢ与ＰⅢＮＰ检测对慢性肝炎肝纤维化的诊断均有意义，ＰⅢＮＰ在早期诊断肝纤维化方面比ＰＣⅢ敏感。

结合肽抑制鸭乙型肝炎病毒复制作用的研究

目的探讨与鸭乙型肝炎病毒多聚酶(DHBVP)特异结合的结合肽,对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染的原代鸭肝细胞中DHBV复制的抑制作用。方法应用噬菌体表面展示技术(PDT)筛选出与DHBVP特异结合的结合肽,经测序得知其核苷酸序列,推论出其氨基酸序列,据此合成结合肽,将其作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞,分时段检测细胞核、细胞浆及培养上清中的DHBV-DNA。结果应用噬菌体展示技术筛选3轮后共筛到7条结合肽,根据推论出的氨基酸序列合成结合肽,作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞,其中3号肽、6号肽的培养上清及胞浆中的DHBV-DNA含量低于对照组(P<0.05)。结论与DHBVP特异结合的结合肽对DHBV的复制有抑制作用。

高效抗逆转录病毒治疗对T细胞亚群上第二受体影响的研究

目的 :研究高效抗逆转录病毒治疗 (HAART)后 T细胞亚群上第二受体的变化及其意义。方法 :采用流式细胞仪检测 CD4 + 、CD8+ 、CD4 + CD4 5 RA+ 以及 CD4 + CD4 5 RO+ 细胞表面 CCR5及 CXCR4的表达水平。结果 :HIV感染后 ,第二受体在 CD4和 CD8以及记忆型和处女型 CD4 T细胞亚群上的表达水平 ,与正常对照没有显著性差异。 HAART治疗仅能在一定程度上改变细胞表面的第二受体水平。结论 :第二受体参与了 HIV的致病过程 ,B期之前开始抗病毒治疗将有较好的疗效。

人骨髓间充质干细胞分离培养的细胞周期及表面抗原研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(BMSC)分离培养的细胞周期及细胞表面抗原特性。方法 应用离心法分离培养人BMSC;应用流式细胞学技术测定细胞周期及细胞表面抗原特征。结果 培养的BMSC呈多种形态。细胞周期分析显示G0+G1的比例为88.4％,S+G2+M的比例为11.6％。CD分子阳性细胞百分率结果显示CD29、CD44、HLA-ABC、CD45、CD80、CD34、CD38、HLA-DR分别为86.00％、71.52%、80.45％、71.45％、2.27％、2.83％、5.86％、1.88％。结论 BMSC具有独特的细胞遗传学和免疫学特征。

聚乙二醇定点修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的研究

研究了重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的聚乙二醇化修饰、分离纯化和活性鉴定。通过对人重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)第1,3,4,5,17位氨基酸进行突变,并在C末端加了一个半胱氨酸,获得了体外活性为原型rhG-CSF150%以上的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)。然后用分子量为20kD的甲氧聚乙二醇马来酸酐(mPEG-Mal)修饰rmhG-CSF,反应混合物经离子交换和凝胶过滤柱纯化,得到纯化的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)。SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的PEG-rmhG-CSF的纯度大于95%,体外活性分析表明PEG-rmhG-CSF活性优于目前临床使用的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF,NeulastaR○),药代动力学研究表明PEG-rmhG-CSF体内半衰期约为14h,比修饰前延长了7倍。

拉米夫定耐药者体内乙型肝炎病毒水平与YMDD变异关系的研究

目的 :探讨拉米夫定耐药者 YMDD变异类型、变异率及与体内病毒水平的关系。方法 :荧光定量 PCR检测拉米夫定耐药者血清 HBV-DNA浓度 ,PCR产物直接测序检测 YMDD变异情况。结果 :5 2例拉米夫定耐药者 YMDD变异检测结果 ,其中有 2 4例发生 YMDD变异 ,占 46.1 5 % ,并且 YMDD(酪氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、天门冬氨酸 )基序发生三种变异 ,第一种类型为 YVDD变异 ,共有 1 1例 (变异率 2 1 .1 5 % ) ,即核苷酸 A741→ G变异 ;第二种类型为 YIDD变异 ,共有 1 1例(变异率 2 1 .1 5 % ) ,即核苷酸 G743→ T变异 ,其中有 1例核苷酸 G743→ C变异也引起 YIDD变异 ;第三种类型为 YLDD变异 ,共有 2例 (变异率 3 .85 % ) ,即核苷酸 A741→ T变异。 YMDD野生型血清病毒浓度为 7.0× 1 0 6± 1 .3× 1 0 6 copies/ ml,YVDD、YIDD、YLDD变异型病毒浓度分别为 7.5×1 0 6 ± 1 .5× 1 0 6 copies/ ml、7.6× 1 0 6 ± 1 .7× 1 0 6 copies/ ml、6.9× 1 0 6 ± 1 .3× 1 0 6 copies/ ml;经 t检验 ,YMDD变异型与 YMDD野生型血清病毒浓度之间的差异无显著性意义 (P>0 .0 5 )。结论 :除已报道的拉米夫定耐药者 YMDD基序发生 YVDD和 YIDD变异外 ,还存在 YLDD变异 ;拉米夫定耐药者体内乙肝病毒水平与发生

艾滋病相关的卡波西肉瘤免疫激活状态研究

目的 :进一步探讨免疫功能改变在艾滋病相关的卡波西肉瘤 (AIDS- KS)发病中的作用。方法 :对 12例AIDS- KS,32例无卡波西肉瘤的 HIV感染者 (HIV- NKS)和 16例正常对照进行了研究 ,用 EL ISA对 8例 AIDS- KS,2 8例 HIV- NKS和 16例正常对照血清 (或血浆 )进行了 s Fas,β 2 -微球蛋白 (β 2 - MG) ,IL - 10 ,IL- 16 ,IL- 18,IL- 6和可溶性 IL - 4受体 (s IL- 4R)测定 ,对 12例 AIDS- KS,32例 HIV- NKS外周血淋巴细胞、淋巴细胞亚群及 CD38+CD8,HLA- DR+ CD8进行了分析。结果 :β 2 - MG,s IL- 4R水平在 HIV- NKS组明显高于正常对照组 ,IL- 16水平在HIV- NKS组明显低于正常对照组 ,IL - 18水平在 HIV- NKS组和 AIDS- KS组均明显高于正常对照组 ;CD3、CD4、CD8、NK、HLA- DR+ CD8在 AIDS- KS均低于 HIV- NKS,而 AIDS- KS组 CD19、CD38+ CD8高于 HIV- NKS组 ,但各组间差异无显著性。结论 :AIDS- KS和 HIV- NKS一样存在一定程度的免疫激活 ,但 AIDS- KS和 HIV- NKS间免疫状态无明显差异 ,提示免疫状态的差异可能不是艾滋病患者并发卡波西肉瘤的主要原因。

淋巴细胞恶性增殖病患者丙型肝炎病毒感染的研究

目的 :研究淋巴细胞恶性增殖性疾病 ( MPL D)患者丙型肝炎病毒感染情况及病毒基因型分布。方法 :用逆转录 PCR( RT- PCR)法对 76例 MPL D和 118例体检人群血清进行 HCV- RNA检测 ,同时用 Okamoto HCV基因分型法进行 HCV基因分型。结果 :76例 MPL D中 HCV - RNA阳性 10例 ( 13.16 % ) ,其中 2 1例非霍奇金淋巴瘤 ( NHL )中 2例阳性 ( 9.5 2 % ) ,39例多发性骨髓瘤 ( MM)中 7例阳性 ( 17.95 % ) ,16例急性淋巴细胞白血病( AL L )中 1例阳性 ( 6 .2 5 % ) ,118例体检人员中 1例阳性 ( 0 .85 % )。对 HCV感染病例 HCV分型发现 ,10例 HCV感染患者均感染 HCV- 型 ,其中 MM中 1例混合感染 HCV- 型 ,1例混合感染 HCV- 型。结论 :MPL D患者有较高的 HCV感染 ,以 MM的 HCV感染最高 ,HCV- 型是 MPL D患者

IFN-α/β信号传导研究进展

IFN-α/β是由病毒感染细胞产生并具有多种生物学活性的细胞因子。IFN-α/β通过与细胞表面的特异性受体IFNAR结合,在其效应细胞中诱导多条信号途径发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。近来研究表明,除了经典的JAK-STAT途径外,IFN-α/β还能诱导p38 MAPK、IRS和CrkL等信号传导途径,介导不同的生物学效应。

慢性乙型肝炎治疗的若干研究进展

近年来,乙型肝炎治疗取得了较大进展,继拉米夫定在临床上广泛应用后,又发现一批新的具有抗乙型肝炎病毒作用的核苷类药物,其中部分已进入临床研究阶段。免疫调节剂的使用经验更为丰富,在剂型上也有较大的改进。此外,对乙型肝炎在抗纤维化治疗、基因治疗和中医中药治疗方面均有所进展。

拉米夫定治疗鸭乙肝停药后肝脏病理研究

目的 用鸭乙肝模型研究拉米夫定对鸭乙肝病毒的抑制效率以及停药后肝脏病理变化。方法 DHBV阳性血清感染 1日龄樱桃谷鸭 ,制备鸭乙肝模型。感染后第 2周选DHBV阳性鸭进行拉米夫定治疗 ,以生理盐水为对照组 ,连续治疗 3个月 ,于治疗前、治疗后、停药后 1个月、 2个月、 3个月每组杀 10只樱桃谷鸭 ,取肝脏及血清 ,观察血清中病毒滴度变化、肝细胞变性程度及肝脏炎性程度的动态变化。结果 治疗结束时拉米夫定治疗组鸭血清中乙肝病毒滴度 (8847 0± 5 3 71 9)、肝细胞变性程度 (1 3± 0 5 )及肝脏炎性程度 (3 6± 1 5 )均明显低于对照组 (13 661 8± 70 3 5 8,3 8± 0 8,7 7± 2 9) ,但与正常组 (2 72 7 4± 995 4)相比 ,病毒滴度仍然显著升高。停药后 1个月病毒滴度有所回升 ,其后下降。肝细胞变性程度及肝脏炎性程度仍维持较低水平。结论 拉米夫定治疗鸭乙肝病毒感染具有较为明显的、迅速的效果 ,停药后第一个月反跳明显 ,提示停用拉米夫定的第一个月应加强其他抗病毒治疗。