实时荧光定量聚合酶链反应测定表皮生长因子Ⅲ突变体表达的方法构建及其应用

目的构建含有表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ）的重组质粒，建立实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术测定EGFRvⅢ的标准曲线，以定量检测喉鳞癌组织中EGFRvⅢ的表达水平。方法以重叠延伸PCR法构建含EGFR第1外显子及第8至部分第9外显子的融合序列。再以融合序列为模板，以高特异性的引物扩增EGFRvⅢ的目的片段，构建含有EGFRvⅢ的重组质粒，进行测序鉴定。将此质粒作为标准品进行梯度稀释，以TaqMan探针实时荧光定量PCR进行检测，建立标准曲线。并以此技术对32例喉鳞癌组织中EGFRvⅢ mRNA表达水平进行测定。结果经测序鉴定，含EGFRvⅢ的重组质粒标准品构建成功，以不同稀释水平的标准品质粒进行荧光定量PCR扩增所得的标准曲线，可用于EGFRvⅢ定量分析。32例喉鳞癌组织中共有5例检测到EGFRvⅢ的表达，阳性率为15．6％。除1例癌旁组织中存在极少量的EGFRvⅢ表达外，EGFRvⅢ均在肿瘤组织中表达。结论用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术定量研究EGFRvⅢ的方法已构建成功，在喉癌组织中的成功运用已证明该方法切实可行，并且较为准确可靠。EGFRvⅢ在喉癌组织中有表达，但是阳性率及含量不高，是否能成为喉癌生物治疗的特异性攻击靶点尚待进一步探索。

喉癌组织中表皮生长因子受体mRNA含量测定

目的建立 TagMan 探针逆转录一实时荧光定量 PCR 技术测定喉癌组织中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)mRNA 水平的方法,分析其应用价值。方法设计高特异性引物和探针,以 TagMan 探针逆转录-实时荧光定量 PCR 技术对32例喉鳞状细胞癌组织和癌旁组织学正常喉黏膜组织 EGFR mRNA 表达水平进行测定。构建含有 EGFR 的重组质粒,进行测序鉴定。结果经测序分析证实,含 EGFR 的重组质粒构建成功,喉癌组织中 EGFR mRNA 相对含量(中位数0.025)高于癌旁正常喉黏膜组织中 EGFR mRNA 相对含量(中位数0.008),两者间的差异经Wilcoxon 秩和检验,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 TagMan 探针逆转录-实时荧光定量 PCR 技术可作为一种喉癌组织中 EGFR mRNA 水平定量测定的新方法。