单层法诱导小鼠胚胎干细胞的成骨分化研究

目的以单层贴壁方法,高浓度维甲酸处理小鼠胚胎干细胞,以期建立一种高效成骨诱导的新体系。方法将差速贴壁后的小鼠胚胎干细胞以1.5×104个/cm2的密度接种,成骨培养液+10μmol/ml维甲酸诱导,4d后更换为成骨诱导液,直至28d,同时通过细胞的形态学观察、RT-PCR、茜素红染色对其成骨分化进行鉴定。结果随着分化时间的延长,胚胎干细胞逐渐分化为梭形细胞,且呈漩涡状排列,至分化15d左右产生结节样团块,21d时结节样物质较普遍。RT-PCR检测表明成骨诱导14d时,表达CD73+和I型胶原,说明细胞继续向成骨分化,且已进入了基质分泌阶段。21d时,表达Ⅰ型胶原和骨钙素,表明已产生了成熟的成骨细胞,并进入了矿化后期。同时成骨诱导28d时,茜素红染色显示细胞已产生大量钙结节。结论以高浓度维甲酸,在单层贴壁状态下对小鼠胚胎干细胞进行诱导,可获得大量成熟、具备矿质化特性的成骨细胞,为成骨细胞的体外诱导分化提供了新的途径,同时该体系也成为体外探讨成骨细胞表型决定机制的一个重要模型。