微小RNA-138/NGAL对缺血再灌注诱导人肾小管上皮细胞的影响

目的探究微小RNA-138(microRNA-138,miR-138)调控中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)对缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)诱导人肾小管上皮(HK-2)细胞损伤的影响。方法HK-2细胞构建I/R模型,分别转染miR-138模拟物、miR-138抑制剂、NGAL、NGAL+miR-138模拟质粒,qRT-PCR测定不同细胞miR-138或NGAL mRNA表达鉴定转染结果,细胞活力检测(cell counting kit-8,CCK-8)法和流式细胞术测定细胞活性和凋亡。ELISA、Western blot法分别测定miR-138模拟物、miR-138抑制剂对I/R细胞白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,以及Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor-NF-κB,IκBα)、磷酸IκBα(p-IκBα)、NGAL蛋白表达的影响。结果I/R细胞miR-138 mRNA表达、细胞活力降低,凋亡增加(P<0.01)。质粒转染成功,miR-138模拟物促进IR细胞活力,降低凋亡和NGAL mRNA表达(P<0.01);miR-138抑制剂、NGAL模拟降低IR细胞活力,增加凋亡和NGAL mRNA表达(P<0.01);NGAL模拟对IR细胞的损伤作用可被miR-138模拟逆转。miR-138抑制剂可增加I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡,上调TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达,下调IκBα蛋白表达(P<0.05);miR-138模拟物可降低I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡,下调TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达,上调IκBα蛋白表达(P<0.05)。结论miR-138通过调节NGAL和TLR4/NF-κB途径降低细胞凋亡和炎症因子水平,对I/R诱导的HK-2细胞发挥保护作用。

LncRNA HCG18调控miR-185-5p/AGER轴影响糖尿病肾病内质网应激和自噬

目的本研究旨在探讨LncRNA HCG18调控miR-185-5p/AGER轴对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)内质网应激和自噬的影响。方法收集DN患者肾脏组织,建立高糖(high glucose,HG)诱导的足细胞损伤模型。检测DN患者肾组织与DN细胞模型中HCG18的表达。确定HCG18在细胞中的定位表达。证实HCG18与miR-185-5p、miR-185-5p与晚期糖基化终产物特异性受体(advanced glycosylation end-product specific receptor,AGER)的调控关系。qRT-PCR和western blot检测内质网应激相关因子(CHOP、XBP1)及自噬相关因子(Beclin-1、p62)的表达。结果相对于非DN患者,DN患者肾组织中HCG18高表达(P<0.05)。相对于正常糖(normal glucose,NG)组,HG模型中内质网应激相关因子(CHOP、XBP1)的mRNA和蛋白表达增加而自噬相关因子Beclin-1的mRNA和蛋白表达被抑制,p62的mRNA和蛋白表达增强(均P<0.05)。HCG18通过调控miR-185-5p/AGER轴发挥生物学作用。敲低HCG18能减轻内质网应激,激活自噬并减少足细胞损伤,该作用被miR-185-5p抑制剂部分逆转。结论HCG18调控miR-185-5p/AGER信号轴并通过调控内质网应激和自噬促进DN的发生。

miRNA-135b上调APC基因甲基化在2型糖尿病肾病发生、发展中的作用及分子机制

目的本研究旨在探讨外周血中APC基因DNA甲基化与糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)发生、发展的关系,分析其对基因转录和蛋白表达水平的影响,探讨miRNA135b对APC基因甲基化水平的调控作用。方法选择2018年3月至2020年3月在浙江大学附属杭州市第一人民医院肾内科的96例DN患者和同期100例健康体检者作为研究对象,分别检测两组APC基因CpG岛甲基化水平、mRNA水平和蛋白表达水平。用三联法构建Sprague-Dawely(SD)大鼠DN模型,分为DN组、miRNA-135b过表达慢病毒组和空载病毒组,将miRNA-135b过表达慢病毒和空载病毒通过尾静脉注射到大鼠体内,1个月后处死大鼠,测定其肾组织中的miRNA-135b的表达水平和APC基因甲基化水平。结果DN患者的APC-1岛的甲基化水平为(3.05±0.65)%,显著高于健康对照组的甲基化水平(2.34±0.56)%(t=5.231,P<0.001);DN患者的APC-2岛的甲基化水平为(1.65±0.37)%,显著高于健康对照组的甲基化水平(1.17±0.29)%(t=4.381,P<0.001);Pearson相关分析结果显示,APC-1岛的甲基化水平与血清肌酐和尿酸比值呈显著正相关关系(P均<0.05),APC-2岛的甲基化水平与尿酸呈显著正相关(P<0.05);DN患者APC-1岛的甲基化水平与mRNA相对表达量间呈显著负相关(r=-0.426,P=0.019);此外,DN患者的APC-1岛的甲基化水平与APC蛋白水平间呈显著负相关(r=-0.569,P=0.004)。miRNA-135b在过表达慢病毒组大鼠中的表达均显著高于空载病毒组(t=5.432,P<0.001)和DN组大鼠(t=5.812,P<0.001);miRNA-135b过表达慢病毒组大鼠的APC甲基化水平也均显著高于DN组(t=6.217,P<0.001)和空载病毒组大鼠(t=6.446,P<0.001)。结论miRNA-135b可能通过上调APC基因DNA甲基化,降低mRNA和蛋白表达水平,从而参与到DN的发生、发展中。