应用影像导航精准注射小干扰RNA-Piezo1修饰骨髓间充质干细胞来源外泌体在骨关节炎动物模型中的修复研究

目的 :探讨小干扰RNA (small interference RNA,siRNA) Piezo1沉默质粒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源外泌体对骨关节炎(osteoarthritis,OA)动物模型的作用。方法:选取雄性SD大鼠SPF级20只,月龄5.46~6.96(6.21±0.75)个月,体重385.76~428.66(407.21±21.45) g,提取大鼠的BMSCs,利用siRNA技术构建Piezo1的siRNA沉默质粒,慢病毒转染BMSCs后,提取外泌体。在细胞层面,根据是否转染siRNAPiezo1,将BMSCs分成空白质粒组和siRNA沉默质粒组,利用RT-PCR和Western blot法检测siRNA-Piezo1对BMSCs的成骨诱导能力。在动物模型层面,利用手术切除膝关节交叉韧带的方案制备OA动物模型,根据处理方案不同,将SD大鼠分为4组,空白对照组,模型组,BMSCs组和外泌体组。空白对照组大鼠不做处理;模型组大鼠切除交叉韧带后,构建OA动物模型;BMSCs组大鼠OA模型建成后,在CT引导下膝关节腔内注射BMSCs,细胞量为5×105个/ml,加载量2 ml,每周2次,持续4周;外泌体组大鼠OA模型建成后,加入siRNA-BMSCs来源的100μg外泌体,每周2次,持续4周。采用苏木精-伊红(HE)染色和番红-固绿染色检测动物模型的软骨情况,并用改良Minkin评分和国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)评分量化处理。反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测软骨组织中多聚蛋白多糖(Aggrecan)Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)的mRNA相对表达水平。结果:慢病毒转染效率为(92.11±4.22)%。RT-PCR结果显示,空白质粒组Piezo1 mRNA的相对表达量为1.07±0.06,与siRNA沉默质粒组0.31±0.01比较,差异有统计学意义(t=2.907,P<0.05)。HE染色和番红-固绿染色结果显示,空白对照组大鼠膝关节软骨结构存在,软骨面光滑。模型组大鼠膝关节结构已经完全破坏,BMSCs组大鼠膝关节软骨结构欠清晰,外泌体组大鼠膝关节软骨下骨成分存在。膝关节HE染色的改良Minkin评分结果和番红固绿染色的OARSI评分结果比较差异有统计学意义(F=15.903,19.005;P<0.05),外泌体组修复效果优于BMSCs组和模型组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,BMSCs组中Aggrecan的mRNA相对表达量高于模型组(P<0.05),外泌体组中Aggrecan的mRNA相对表达量高于BMSCs组和模型组(P<0.05)。BMSCs组中CollagenⅡ的mRNA相对表达量高于模型组(P<0.05),外泌体组中CollagenⅡ的mRNA相对表达量高于BMSCs组和模型组(P<0.05)。结论:Piezo1 siRNA沉默载体可以促进BMSCs向软骨细胞分化,并且可以有效抑制OA的进展,延缓OA的病情。