模拟移动床色谱技术分离果糖研究进展

主要综述了模拟移动床(Simulated Moving Bed,SMB)色谱分离技术从果葡糖浆中分离果糖的应用研究进展。从工作原理、固定相、阀系统、自动化控制、数学模型及工艺参数优化等方面对SMB技术进行了系统介绍,为我国的高纯果糖浆和结晶果糖的产业发展提供参考意见。

代谢工程改造Escherichia coli生产3-羟基丙酸

以提高3-羟基丙酸的产量为目标,对实验室构建的基因工程大肠杆菌进行改造,敲除形成副产物1,3-丙二醇的主要酶基因——乙醛脱氢酶基因yqh D,得到E.coli W3110Δyqh D(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.53 g/L,相比未敲除yqh D基因的菌株,产量提高了5.8倍。另外,敲除了甘油代谢途径中的抑制因子glpR基因,得到E.coli W3110ΔglpR(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.86 g/L,相比未敲除glpR基因的菌株,产量提高了6.7倍。后经5 L罐发酵培养后,3-羟基丙酸的产量提升到15.4 g/L。该实验为进一步利用大肠杆菌工程菌发酵生产3-羟基丙酸提供了研究基础。

琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的表达、纯化及酶学性质分析

人工合成琥珀酸半醛脱氢酶Gab D4基因,经蛋白表达和纯化,对其酶学性质进行研究。结果表明,Gab D4的最适反应温度为37℃;最适p H为7.5（磷酸盐缓冲液）或9.0（甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）;金属离子中,Cu2＋对Gab D4酶活力的影响较大;Gab D4对3~5个碳的醛底物具有更高的催化效率;以乙醛为底物,计算得到米氏常数（Km）、最大反应速率（Vmax）分别为6.86 mmol/L和20.6μmol/（min·mg protein）。该结果为深入了解Gab D4的酶学性质提供参考。

不同醛脱氢酶对重组克雷伯氏菌生产3-羟基丙酸的影响

PCR扩增Cupriavidus necator Gab D4和Azospirillum brasilense KGSADH醛脱氢酶基因,分别与经改造获得卡那霉素抗性的p UC19质粒(p UC19Kan)连接,再转化至Klebsiella pneumoniae DSM2026,获得重组菌KpKan/KGSADH和KpKan/Gab D4。经摇瓶发酵,KpKan/KGSADH和KpKan/Gab D4的最高3-羟基丙酸(3-HP)产量分别为3.66与2.56 g/L,与未导入醛脱氢酶的K.pneumoniae对照菌相比,分别提高了352%与216%。对其他产物的研究表明,2株重组菌的1,3-丙二醇(1,3-PDO)的产量低于对照菌,而2,3-丁二醇(2,3-BD)和乙酸产量高于对照菌。该研究首次将C.necator Gab D4醛脱氢酶基因导入K.pneumoniae,并对比了KpKan/KGSADH与KpKan/Gab D4的3-HP产量,实验中确定的性能优良的发酵菌株为继续提高3-HP产量提供了帮助。

摩氏摩根菌ZJB-09203酯酶的分离纯化及性质

立体选择性水解2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)是化学-酶法合成重大疾病治疗药物普瑞巴林的关键步骤。分离纯化了能够高效水解S-型CNDE的摩氏摩根菌ZJB-09203胞内酯水解酶,并进行酶学性质研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose 6 FF疏水柱层析、DEAE Sephadex A-50阴离子交换和羟基磷灰石Bio-Scale CHT层析,纯化得到电泳纯的酯水解酶。SDS-PAGE和凝胶过滤HPLC分析确定该酶为单亚基蛋白,分子量为68 kDa。不同碳链长度p-硝基苯酚酯特异性酶解结果表明,该酶为酯酶,酶促合成普瑞巴林手性中间体(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的最适pH为9.0,最适温度为45℃,且在pH 7.0-9.0和40℃条件下具有良好的稳定性。Ca2+、Cu2+、Mn2+对酶活有一定的促进作用,Co2+、Fe3+、Ni2+及EDTA对酶活有较强的抑制作用。此外,考察了该酯酶水解p-硝基苯酚酯的动力学参数,及CNDE浓度对转化率的影响。首次报道了能够立体选择性水解CNDE的酯酶,相关酶学性质研究将为该酶催化合成普瑞巴林手性中间体的工业化应用提供重要依据。