多房棘球蚴囊液对小鼠肝细胞凋亡与自噬影响的研究

背景多房棘球蚴病是一种流行于北半球的人兽共患寄生虫病,由于不能形成完整的“囊壁”,其病灶中的囊液持续外渗,不断刺激宿主肝细胞,使肝细胞出现“丢失”的情况。目的初步探究多房棘球蚴囊液(hydatid cyst fluid,HCF)对小鼠肝AML-12细胞凋亡与自噬的影响。方法CCK-8法筛选合适的HCF浓度后,将小鼠AML-12细胞分为对照组、HCF 0.4 mg/mL组和HCF 0.8 mg/mL组。CCK-8法检测各组小鼠肝AML-12细胞活性(浓度选择);流式细胞术检测小鼠肝AML-12细胞凋亡情况;Western blot法检测DDIT4、Beclin-1、Caspase-3、PCNA、LC3等凋亡自噬相关蛋白的表达情况;单丹磺酰尸胺(monodansyl cadaverine,MDC)法检测细胞自噬的情况,透射电镜下观察HCF对小鼠肝AML-12细胞超微结构的影响。结果CCK-8结果显示24 h、48 h、72 h时0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL HCF组和48 h、72 h时0.4 mg/mL HCF组的AML-12细胞增殖抑制率均较对照组明显升高(P<0.01);流式细胞计数检测结果显示0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF作用于细胞48 h后细胞凋亡率明显升高(P<0.01);MDC法结果显示0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF作用于细胞48 h后出现大量高亮度类圆形团块,平均荧光强度明显升高(P<0.01);Western blot法检测结果显示,与对照组相比,0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF组DDIT4、PCNA、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达显著升高(P<0.01);与0.4 mg/mL HCF组相比,0.8 mg/mL HCF组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达显著升高(P<0.05)。透射电镜下可见对照组细胞质未见明显肿胀,线粒体基质较均匀,嵴少量减少,自噬水平低;0.4 mg/mL HCF组线粒体损伤程度较低,轻微肿胀,嵴少量断裂,胞内可见较多自噬溶酶体;0.8 mg/mL HCF组细胞线粒体损伤程度高,线粒体膜破损、基质外溢,嵴缺失,胞内可见较大面积自噬溶酶体。结论HCF对体外培养的AML-12细胞的增殖有明显抑制作用,DDIT4表达增高,并促进AML-12细胞自噬的发生,诱导细胞凋亡。