曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)促性腺激素释放激素(GnRH)基因的鉴定、特征及成熟期的表达研究

促性腺激素释放激素(GnRH)在脊椎动物的繁殖过程中起着至关重要的作用,同时也存在于许多无脊椎动物中。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆出曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)促性腺激素释放激素(命名为SjGnRH,KP 982885.1)。SjGnRH基因的cDNA全长710 bp,开放阅读框(ORF)为273 bp,编码90个氨基酸,包括一条含有31个氨基酸的信号肽、12个氨基酸的GnRH多肽和44个氨基酸的GnRH相关肽(GAP);SjGnRH与剑尖枪乌贼(Uroteuthis edulis)和真蛸(Octopus vulgaris)的同源性分别为86.7%和73.3%;SjGnRH高度保守的十二肽与剑尖枪乌贼和真蛸的octGnRH相似度达100%,其信号肽的相似性分别为66.7%和54.8%,GAP区的相似性分别为95.5%和77.3%;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,SjGnRH基因在成熟期的表达具有特异性,在脑中表达量最高,且与其他组织差异显著(P<0.05);采用原位杂交技术检测SjGnRH mRNA在脑内的表达模式,结果表明:SjGnRH在食道上神经团、食道下神经团和视叶的不同部位均有表达,暗示SjGnRH可能参与曼氏无针乌贼的生殖调控作用。

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)精子表面蛋白17(Sp17)基因克隆以及组织表达特异性分析

精子表面蛋白17(Sp17)是参与受精过程的关键分子。本研究采用RT-PCR以及RACE技术克隆得到了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Sp17简称Sj-Sp17 c DNA的全长序列,序列全长1463bp,5′和3′非编码区分别为92bp和222bp,预测的开放阅读框(ORF)全长1149bp。编码的蛋白理论分子量为42.0548k Da,等电点4.66,是一种亲水性蛋白,不存在跨膜区以及信号肽序列,含有丰富的螺旋结构(54%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他软体动物的相似性最高仅为44%,表明Sp17在进化中并不保守。基于Sp17氨基酸序列构建的系统进化分析表明,曼氏无针乌贼和加州双斑蛸(Octopus bimaculoides)进化关系最近。组织特异性分析发现Sp17在曼氏无针乌贼的生殖系统中均有较高的表达量,其中在精巢和储精囊中有显著表达。Sp17基因的成功克隆以及组织表达特异性分析对于深入研究其细胞定位以及生物学功能具有重要意义。

曼氏无针乌贼精子鞭毛蛋白1(Spef1)基因克隆以及组织表达特异性

为研究精子鞭毛蛋白1(Spef1)在精子鞭毛结构的形成与组装中的生物学意义及功能,本研究采用RACE技术和荧光定量PCR技术对曼氏无针乌贼Spef1(简称Sj Spef1)基因cD NA全长进行克隆和组织表达特异性分析。结果显示,SjS pef1 cD NA全长序列共1 135 bp,5′和3′非编码区分别为178 bp和165 bp,预测的开放阅读框(ORF)全长792 bp。编码的蛋白理论分子量为30.567 7 ku,等电点7.03,是一种亲水性蛋白。不存在跨膜区以及信号肽序列,是在细胞内发挥作用的蛋白。二级结构分析发现该蛋白含有丰富的螺旋结构(49%)。氨基酸同源建模显示其蛋白的CH2结构域主要由4个螺旋结构组成,并由多个loop结构串联而成。同源氨基酸序列比对发现,它与加州双斑蛸的相似性最高且仅为59.49%,表明Spef1在进化中并不保守。基于Spef1氨基酸序列构建的系统进化分析表明,曼氏无针乌贼和加州双斑蛸进化关系最近。组织特异性分析表明Spef1在曼氏无针乌贼的精巢中有显著表达。Spef1基因的成功克隆以及组织表达特异性分析对于深入研究其细胞定位以及生物学功能具有重要意义。

神经肽FF在小黄鱼(Larimichthys polyactis)性腺发育早期的表达与定位分析

神经肽FF是属于RFamide相关肽家族中的一种八肽,在多种生物过程中具有调节功能。本文开展了小黄鱼(Larimichthys polyactis)神经肽FF相关基因(LpNPFF:Accession No.MT012894)的组织表达与定位分析研究。实时荧光定量PCR结果显示,小黄鱼神经肽FF基因在性未成熟期(第Ⅱ期)的小黄鱼的脑和性腺中表达较高,其次是肌肉和脾脏,在胃和肠中表达相对较少;原位杂交结果显示,在小黄鱼中脑的视顶盖(OTec)、圆环体(TL)、结节前核(NAT)、外侧结节核(NLT)、下丘脑弥散核(NDLI)以及延脑(MO)中检测到大量LpNPFF mRNA阳性的细胞,而端脑和小脑部分的表达较少。同时,在小黄鱼第Ⅱ期卵巢细胞的细胞质和核仁中也能观察到明显的阳性信号;免疫组织化学结果显示,在小黄鱼脑部表层细胞和卵巢壁周围的结缔组织中可见明显的RFamide免疫阳性纤维。上述研究结果有助于神经肽进化的深入研究,也为进一步探索NPFF相关基因在生殖调控方面的潜在功能提供了新的思路。