长鳍金枪鱼多肽制备及其对H2O2诱导的张氏肝细胞的保护作用

目的:以长鳍金枪鱼废弃物为原料提取多肽,探究其对H2O2诱导的张氏肝细胞的保护作用。方法:以H2O2诱导张氏肝细胞损伤建立细胞模型组,以相对增殖率为指标筛选长鳍金枪鱼废弃物最适酶种,通过正交试验确定最佳酶解条件。酶解产物经超滤、阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱方法纯化分离得到多肽,用噻唑蓝(MTT)比色法对其每步分离效果进行评价。多肽活性的评价是利用试剂盒方法测定张氏肝细胞上清液中AST、ALT、MDA、ADH和SOD的含量,倒置显微镜观察细胞形态及流式细胞仪检测多肽对H2O2诱导后的张氏肝细胞凋亡的影响。结果:最适酶种为胰蛋白酶,最佳酶解条件为料液比1∶3(g/mL),pH 9,加酶量900 U/g,温度45℃,时间5 h。经一系列纯化后制成多肽,命名为长鳍金枪鱼多肽。其氨基酸序列为Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Cys-Phe-Lys。经长鳍金枪鱼多肽作用于H2O2诱导的张氏肝细胞后,ALT、AST、ADH和MDA含量下降,SOD含量上升。通过流式细胞仪检测发现晚期凋亡细胞相比于模型组减少明显。结论:利用酶解方法提取的长鳍金枪鱼多肽对H2O2损伤的张氏肝细胞具有一定的保护作用。

北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备

为探讨北太平洋鱿鱼(Todarodes pacificus)缠卵腺酶解寡肽的制备和抗氧化活性,以北太平洋鱿鱼缠卵腺为原料,选择碱性蛋白酶进行酶解,以水解度和DPPH自由基清除率为指标,经单因素和正交试验方法获得最佳酶解条件,超滤得到不同分子段多肽,通过测定还原能力、DPPH清除率、Fe^(2+)螯合能力、OH自由基清除率、超氧阴离子清除率评价不同分子量酶解多肽的抗氧化性,得出最佳分子段;采用琼脂糖凝胶G-25对最佳分子段进行分离,检测各峰对DPPH清除能力,得出最佳峰段后经HPLC进一步分离获得单一组分,由氨基酸测序仪进行N端降解测序得出目标肽序列。结果表明,碱性蛋白酶的酶解条件为温度50℃、酶解时间7 h、加酶量3 500 U/g、pH 9.0、料液比1∶6。经超滤得到的3～5 ku分子段抗氧化活性最强,经琼脂糖凝胶G-25分离得到3个峰,其中峰Ⅰ组分对DPPH清除率最好,当浓度为0.5 mg/m L时其DPPH的清除率为61.87%。经HPLC纯化得到单一峰,氨基酸序列测定为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser,相对分子质量为497.50。北太平洋鱿鱼缠卵腺酶解寡肽有较好的抗氧化活性。

长鳍金枪鱼多肽的酶解制备工艺研究

通过酶解法制备具有对H_2O_2诱导的张氏肝细胞保护作用的长鳍金枪鱼多肽。以长鳍金枪鱼下脚料为原料,采用胰蛋白酶进行酶解,以张氏肝细胞的相对增殖率为指标,通过单因素试验和响应面优化试验确定该酶的最佳酶解条件, HE染色观察张氏肝细胞形态变化。结果表明,最佳酶解条件为:料酶解pH 7.28,酶解温度45.29℃,时间5.05 h,所得酶解产物对张氏肝细胞的相对增殖率为53.1%。HE染色显示长鳍金枪鱼多肽对H_2O_2诱导的张氏肝细胞起一定保护作用。该工艺研究为长鳍金枪鱼多肽的分离纯化及开发护肝功能食品提供试验依据。

沙蚕蛋白酶的荧光标记及细胞摄取机制研究

该文利用FITC对沙蚕蛋白酶(NAP)进行荧光标记,并通过薄层色谱法、红外光谱法、紫外光谱法及荧光光谱法对标记物进行表征,紫外分光光度法计算标记度。通过测定NAP与FITCNAP的酶促反应动力学参数来比较NAP在标记前后的活性,同时应用MTT法考察NAP标记前后对NCI-H1299细胞毒性的影响。流式细胞术研究NCI-H1299细胞摄取FITC-NAP的机制,荧光显微镜定性观察NCI-H1299细胞对FITC-NAP的摄取。结果表明,每分子标记物约含1.78分子FITC,其最佳荧光激发波长为490 nm、发射波长为515 nm;荧光标记后NAP的活性未受到显著影响; NCI-H1299细胞对FITC-NAP的摄取与药物浓度、作用时间呈正相关;氧化苯砷组的荧光强度低于FITC-NAP组且有极显著差异(P<0.01),因此NAP的摄取机制为内吞。进一步研究发现, NCI-H1299细胞摄取NAP受到网格蛋白依赖性内吞和小窝/脂筏蛋白介导的内吞共同作用。荧光显微镜观察发现,随着时间的增加,更多的细胞摄入FITC-NAP,且主要分布在细胞膜及细胞质中,细胞核中未见分布。