基于网络药理学和分子对接技术探究马齿苋抑制猪炎症反应的作用机制

采用网络药理学和分子对接等技术,挖掘马齿苋抑制猪炎症反应的主要活性成分及关键靶点,探究其可能的作用机制。在中药系统药理学数据库与分析平台和Uniprot(Universal protein)中筛选马齿苋有效成分及靶点,通过GeneCards和疾病靶点数据库,获得炎症相关的靶点;利用Venn网站将马齿苋相关靶点与炎症相关靶点进行映射来构建韦恩图,得到马齿苋抗猪炎症的预测靶点。结合String数据库和Cytoscape软件对预测靶点进一步筛选,获取关键靶点后对其进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,选取排名靠前的关键靶点和活性成分开展分子对接分析。结果表明:筛选得到β-谷甾醇、山柰酚和木犀草素等马齿苋的10个潜在药效成分;马齿苋发挥抗炎作用的核心靶点包括TNF、ALB和TP53等共90个,可参与细胞迁移的正调控、炎症反应、细菌源分子的反应等生物过程,涉及癌症、疟疾、MAPK等信号通路。该研究揭示了马齿苋多成分、多靶点、多途径抑制猪炎症反应的作用机制,为其在实际畜牧养殖中治疗由炎症反应所导致的猪腹泻性相关疾病的具体机制提供理论依据。

家蚕杆状病毒(BmNPV)Bm122基因的缺失影响芽生型病毒粒子的形成

为研究家蚕杆状病毒（BmNPV）编码的Bm122基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别构建了Bm122-ko-bacmid和Bm122-re-bacmid,实现对Bm122基因的敲除和异位补回。进而将Bm122-kobacmid、Bm122-re-bacmid、wtbacmid（野生型）分别转染BmN细胞,病毒滴度测定结果显示：Bm122缺失后,病毒无法形成正常水平的芽生型病毒粒子（budded virus,BV）,表明该基因是病毒生成有感染力的BV所必需的基因;透射电子显微镜观察发现,Bm122敲除后细胞内未观察到杆状病毒粒子,进一步证实Bm122的缺失影响了BV的生成。qPCR结果显示,Bm122缺失后病毒DNA复制水平降低。结果表明,Bm122是病毒生成正常水平的BV所必需的基因。

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bm56缺失对病毒复制和转录的影响

研究Bm56的生物学功能,利用Red重组系统构建了Bm56基因缺失型病毒vBm56-KO-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了Bm56基因补回型病毒vBm56-Re-Bacmid。然后将构建好的上述病毒转染BmN细胞,qPCR研究发现,Bm56敲除型病毒与野生病毒相比,在囊膜病毒(Budded virus,BV)的产量上并没有统计学差异,表明Bm56基因不是病毒形成有感染活力病毒粒子的必需基因。同时qRT-PCR研究结果也显示,Bm56缺失没有明显降低病毒基因组的复制水平,进一步研究Bm56缺失对BmNPV基因转录的影响。qRT-PCR结果显示,Bm56对早晚期和极晚期基因的转录水平均没有明显的影响。说明Bm56不是BmNPV病毒复制的必需基因,对病毒早期基因、晚期基因和极晚期基因的转录水平均无显著影响,推测Bm56可能作为一种病毒结构蛋白,在病毒装配等环节中起着重要作用。

家蚕表达人促红细胞生成素口服急性毒性和初步药效学研究

为了研究家蚕表达的重组人促红细胞生成素(BmrhEPO)口服治疗肾性贫血的疗效并评价安全性,进行了小鼠口服BmrhEPO急性毒性实验,结果显示其对小鼠基本无毒或毒性极低,小鼠口服BmrhEPO最大耐受剂量大于147 882IU/kg。肾性贫血小鼠以剂量为62 865IU/kg和20 955IU/kg的两个剂量组连续口服BmrhEPO一周,以小鼠血液网织红细胞数及百分率为药效指标,结果显示口服有药效,并且药效与剂量呈正相关。本实验为开发重组人促红细胞生成素口服药物提供了理论指导和实验基础。

Bmp24缺失对家蚕核型多角体病毒基因组的复制、转录及病毒组装的影响

研究Bmp24基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统构建Bmp24缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)和Bmp24修复型病毒(Bmp24-re-Bacmid)。然后将Bmp24-ko-Bacmid、Bmp24-re-Bacmid以及野生型病毒(wtBacmid)分别转染BmN细胞,病毒滴度测定发现3种病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞发病,但Bmp24-ko-Bacmid在各个时相的滴度值显著低于其他两种病毒(P<0.05)。电镜观察结果发现Bmp24-ko-Bacmid感染的细胞中只有少量细长的杆状结构,而其他两种病毒感染细胞后能够产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qPCR实验结果显示,Bmp24缺失不会影响病毒基因组的复制,同时qRT-PCR结果显示Bmp24缺失使早期、晚期基因和极晚期基因的转录水平显著低于野生型病毒(P<0.05)。

二步超离心法分离纯化人血浆Apo B100及兔抗人Apo B100抗血清制备

建立一种从人血浆中分离纯化Apo B100的方法,并制备兔抗人Apo B100抗血清。将血浆用溴化钾调成1.019g/mL的密度液进行差分超速离心,将分离产物在溴化钾不连续密度梯度液(1.006～1.210g/mL)中进行等密度超速离心。用G-100葡聚糖凝胶柱纯化Apo B100,以ELISA双抗体夹心法检测浓度,真空冷冻干燥。取冻干粉与弗氏佐剂混合后免疫新西兰白兔,制备兔抗人Apo B100抗血清,利用双向免疫扩散检测抗原纯度与抗血清效价。结果是一步超离法分离的Apo B100最高浓度为0.91μg/mL;二步超离法分离的Apo B100最高浓度为1.40μg/mL,对应的抗血清效价为1∶64。结果表明二步超离心法提高了人血浆Apo B100的分离效果。

SETDB1的生物学功能及其在疾病发生中的作用机理研究进展

组蛋白甲基转移酶家族是表观遗传调控的关键参与者。SET结构域分支型1(SETDB1)是组蛋白甲基转移酶家族的成员,其在组蛋白H3上甲基化赖氨酸9位点,在涉及转录抑制和常染色体基因沉默的生物网络中显示多重功能。该综述总结了SETDB1的结构和功能,以及相关疾病的发生和发展所涉及的分子机制的最新进展,以期对疾病诊断和临床治疗有所帮助。

一种葡聚糖活性检测的新方法

大多具有分支的β-(1-3)-D-葡聚糖具有免疫调节及抗肿瘤活性。文章利用人单核白血病THP-1细胞株建立细胞水平上葡聚糖生物活性的检测方法,实现高通量筛选活性多糖。THP-1细胞在不同浓度的葡聚糖刺激48h后离心收集上清,ELISA法检测其释放细胞因子浓度,以筛选有效的评价指标。结果显示:THP-1细胞在不同葡聚糖刺激下,细胞培养液中IFN-α含量变化明显。IFN-α可作为在细胞水平上评价葡聚糖活性的标准检测指标。该方法既克服了动物实验工作量大、成本高,又克服了原代细胞不稳定等因素,为高通量筛选活性多糖提供了新途径。

基于RD-BmBacmid载体构建表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法

研究构建一种快速表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法。在复制缺陷型的家蚕杆状病毒(BmNPV)穿梭载体RD-BmBacmid基础上,利用PCR方法合成两端分别含有50bp左右同源臂的绿色荧光蛋白基因(AcGFP)片段和线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家蚕幼虫,可以一步获得重组病毒,表达绿色荧光蛋白。实验结果表明,含有AcGFP基因的重组杆状病毒构建成功,在BmN细胞和家蚕幼虫中分别表达了绿色荧光蛋白。因而,本研究成功建立了一种快速构建重组杆状病毒并能够表达GFP蛋白的新方法。

抗PD-L1CAR基因的构建及CAR-T的功能活性研究

鉴于嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)疗法应用于肿瘤治疗的临床试验已取得很大突破,设计了程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1)特异性CAR-T细胞以体外杀伤肺癌细胞。通过克隆表达PD-L1_((73-739)),并纯化PD-L1蛋白以免疫BALB/c小鼠制备获得PD-L1单克隆抗体;克隆PD-L1单克隆抗体单链可变区片段,与CD28、4-1BB、CD3-ζ链的基因体外融合构建第三代CAR基因,并克隆于慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-copGFP上,包装成慢病毒。该慢病毒感染CD^(8+)T细胞,扩增5d,测定CAR的表达,表达率可达到22%以上。PD-L1靶向的肿瘤细胞杀伤作用分析显示,抗PD-L1CAR-T细胞有一定的体外杀伤活性。

类泛素化修饰neddylation与肿瘤发生和治疗

类泛素化修饰neddylation是一种与泛素化类似的蛋白质翻译后修饰,这一过程通过一系列级联反应将标签分子NEDD8结合到靶蛋白上,从而影响被修饰蛋白质的结构功能。包括Cullin家族在内大多数的neddylation修饰底物同时也是泛素连接酶E3的底物或其组成部分,因而,neddylation修饰过程与泛素化一样广泛参与到细胞的生长代谢等生命活动中并对基因的表达调控起着重要的作用。该文着重对neddylation修饰过程与肿瘤相关信号通路和肿瘤微环境之间的联系以及靶向neddylation途径进行癌症治疗的相关研究进行综述。